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A investigação do papel dos GCs nas diferentes etapas da mobilização local de leucócitos vem de longa data, e tem determinado resultados conflitantes até os dias atuais, principalmente quanto à origem endógena ou exógena e a dose de hormônio empregada. Diferentes modelos experimentais têm demonstrado que os GE ou exógenos modulam a migração de leucócitos para o foco da lesão, no entanto o mecanismo de ação não está totalmente esclarecido (FLOWER et al., 1986; MORAES et al., 1987; PEERS et al., 1988; ABE et al., 1995; CASTAGLIUOLO et al., 2001).

Nosso grupo tem investigado o papel dos GE no processo de migração celular. Farsky e colaboradores (1995) demonstraram in vivo, em animais adrenalectomizados (ADR) ou tratados com metopirona (inibidor da síntese de GCs que mantém a atividade de mineralocorticóides), o papel dos GE como moduladores fisiológicos da interação leucócito-endotélio. Nestes animais, o número de leucócitos em comportamento rolling, em condições normais, foi muito maior que o detectado em animais controles falso-operados (FO) ou não manipulados cirurgicamente (NM). A indução de resposta inflamatória exacerbou a interação celular, com consequente aumento no número de células brancas aderidas à parede de vênulas pós-capilares e no interstício adjacente. Adicionalmente, verificou-se a participação do receptor citosólico nestes eventos, uma vez que animais não manipulados tratados com RU 38 486, antagonista do receptor de glicocorticóide, apresentaram os mesmos perfis de interação leucócito-endotélio encontrados nos animais ADR e tratados com metopirona.

A literatura tem demonstrado que, na vigência de estresse, o aumento na concentração de GE circulantes modula a expressão de moléculas de adesão envolvidas no processo. Leech e colaboradores (1998) mostraram que administração de RU 38486 em ratos portadores de artrite aumentou significativamente a expressão de P-selectina na articulação inflamada. Adicionalmente, tem sido bastante evidenciado o papel dos GCs exógenos ou GE, neste último caso em concentrações elevadas, sobre a expressão de L-selectina em neutrófilos circulantes de diferentes espécies animais. Neste contexto, uma relação inversa entre secreção de cortisol e expressão de L-selectina foi demonstrada em pacientes submetidos a estresse cirúrgico. A elevada concentração hormonal dias

41 ___________________________________________________________________________ após a cirurgia coincide com diminuição na expressão de L-selectina (FASSBENDER et al., 1999; SEEKAMP et al., 2001). Nesta mesma linha de evidências, observou-se que a estimulação elétrica de áreas específicas do hipotálamo em gatos, que induz aumento de corticóides e noradrenalina circulantes, causou granulocitose e linfocitopenia. A análise da expressão de moléculas de adesão nestes leucócitos circulantes mostrou incremento na expressão de L- selectina em granulócitos e diminuição em linfócitos CD4 e CD8, efeito que parece não ser dependente de clivagem protéica (KANAME et al., 2002). No entanto, trabalho prévio utilizando o mesmo modelo animal, onde a lesão hipotalâmica acarretou somente aumento na concentração de GCs circulantes, observou-se granulocitose com diminuição da expressão de L-selectina (MORI et al., 2000). Uma série de estudos em bovinos recém-nascidos ou em fêmeas após o parto corroborou os dados citados acima (LEE et al., 1998; PREISLER et al., 2000; WEBER et al., 2001).

Quanto à expressão de integrinas, os dados apresentados na literatura indicam que os GE não interferem com a expressão destas moléculas em leucócitos circulantes. Após estresse cirúrgico, a expressão de integrinas foi discretamente aumentada na vigência de altas concentrações de GCs (FASSBENDER et al., 1999). Corroborando este efeito, TORSTEINSDÓTTIR et al. (1999) demonstraram que o incremento na secreção de GE não altera a expressão de integrinas em leucócitos circulantes de humanos.

Tanto para os GE como para os GCs exógenos, os resultados são conflitantes quanto à ação direta sobre a síntese e/ou expressão de molécula de adesão ou indireta, através da inibição da secreção de mediadores que reconhecidamente ativam a expressão/ativação destas estruturas nas membranas celulares (BARNES & ADDOCK, 1993; DAVENPECK et al., 1998; PIPITONE et al., 2001). A controvérsia sobre o assunto pode ser decorrente da diversidade de condições experimentais, incluindo a dose dos hormônios e os agentes inflamatórios empregados, além das espécies animais testadas. No entanto, não se pode descartar que os efeitos sejam distintos, uma vez que estes hormônios atuam nas diferentes células alvo, por diferentes vias, usando os mecanismos genômicos e não genômicos (PITZALIS et al., 2002).

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1.4 Anexina A-1

A anexina A-1, também conhecida como liporcotina-1, foi descrita por Flower & Blackwell (1979) e identificada como uma proteína de 37kDa induzida por GCs, envolvida na inibição da síntese de eicosanóides e de fosfolipase A2 (FLOWER, 1988). É encontrada em diferentes tecidos e tipos celulares, incluindo mamíferos, aves, roedores, peixes, insetos (MOSS & MORGAN, 2004). Em condições basais, anexina A-1 é encontrada no citoplasma de neutrófilos, macrófagos e monócitos de humanos e de murinos (MORAND et al., 1995; PERRETTI, et al., 2000; MULLA, et al., 2005). Apresenta atividade na regulação da adesão dos neutrófilos (PERRETTI, 1997; OLIANI et al., 2001; GIL et al., 2006) e dos monócitos (SOLITO et al., 2000) às células endoteliais ativadas. Diferentes estudos utilizando modelos experimentais de inflamação têm mostrado que anexina A-1 ou peptídeos bioativos, compreendidos pela sua região N-terminal, promovem inibição no tráfego de neutrófilos do sangue para os tecidos inflamados (LIM et al., 1998; PERRETTI & FLOWER, 2004; LIM & PERVAIZ, 2007). Um possível mecanismo na regulação da migração celular é a interferência da anexina-A1 com moléculas de adesão que medeiam à interação leucócito-endotélio. Experimentos utilizando microscopia confocal verificaram co- localização da anexina A-1 com a α4β1 integrina na superfície de monócitos (SOLITO

et al., 2000). Além disso, De Coupade e colaboradores (2003) propuseram que a anexina-A1 externalizada na superfície celular pelos GCs facilita a clivagem da L- selectina por uma interação dependente de cálcio. Além disso, foi demonstrado que o tratamento com anexina A-1 induziu diminuição da expressão de L-selectina na membrana de neutrófilos atuando na clivagem desta molécula (STRAUSBAUGH & ROSEN, 2001).

Perretti & D’Acquisto (2009) propuseram um mecanismo esquemático da mobilização da anexina A-1 em células ativadas e seu potencial mecanismo de ação (Figura 4). Após ativação celular, a anexina A-1 intracelular é mobilizada para a membrana plasmática. Dependendo do tipo celular, esta é então externalizada e/ou secretada por um dos seguintes mecanismos: ativação do mecanismo transportador ABC (WEIN et al., 2004); fosforilação do seu resíduo de serina na porção amino- terminal (SOLITO et al., 2006); ou fusão de grânulos contendo anexina A-1 com a membrana plasmática com liberação da mesma. Na presença de íons Ca+2, a anexina A-1 extracelular sofre uma mudança conformacional que leva a exposição

43 ___________________________________________________________________________ da região N-terminal e ligação ao seu receptor ALXR (também conhecido como FPR2). A anexina A-1 pode ativar a sinalização por mecanismos autócrinos, parácrinos ou justácrinos. Esta última é o mais plausível mecanismo em condições inflamatórias. A via anexina A-1/ALXR pode ser regulada pelos glicocorticóides, os quais induzem a expressão do gene que codifica esta proteína. Foi demonstrado que a administração de GCs exógenos em pacientes saudáveis acarretou aumento da expressão de anexina A-1 em monócitos e neutrófilos circulantes (GOULDING et al., 1990). Além disso, leucócitos obtidos de pacientes com Síndrome de Cushing, que possuem altos níveis de GE, apresentaram aumento na expressão de anexina A-1 enquanto leucócitos obtidos de pacientes com Síndrome de Addison, que oposicionalemnte possuem baixos níveis de GE apresentaram baixa expressão de anexina A-1 (MULLA et al., 2005). Porém, os mecanismos pelos quais os GCs regulam a expressão de anexina A-1 ainda não são totalmente conhecidos.

Figura 4- Representação esquemática de mobilização da anexina A-1 em células ativadas e seu mecanismo de ação. Após a ativação celular a anexina A-1

(AnxA-1) é mobilizada para a membrana plasmática e externalizada pelos seguintes mecanismos: (a) por ativação transportador ABC; (b) fosforilação do resíduo de serina; (c) fusão do grânulo com a membrana plasmática. Este mecanismo pode ser regulado pelos glicocorticóides (Modelo proposto por Perretti e D’Acquisto, 2009).

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Associados, os dados apresentados aqui mostram que a expressão/ativação de moléculas de adesão, quer seja por ação direta ou indireta, são alvos de ação dos glicocorticóides no processo de migração celular em condições fisiológicas ou em processos de doença de origens inflamatórias. No entanto, os mecanismos moleculares envolvidos nestes eventos ainda não estão completamente conhecidos.

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2. OBJETIVOS

Os objetivos deste trabalho de tese de doutorado foram baseados em resultados prévios que mostraram um controle endógeno dos glicocorticóides sobre a produção e maturação de neutrófilos e suas interações adesivas com o endotélio microvascular do compartimento medular e circulante. Um dos possíveis alvos desse controle foi atribuído à regulação exercida sobre a expressão de L-selectina na membrana de neutrófilos (CAVALCANTI et al., 2006).

Desta forma, no presente trabalho investigamos os mecanismos moleculares e celulares de ação dos glicocorticóides em neutrófilos e células endoteliais nos efeitos relacionados ao tráfego de neutrófilos da medula óssea para o sangue periférico e deste para o tecido extravascular.

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3. MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 Delineamento experimental

Os objetivos propostos neste trabalho foram investigados seguindo os seguintes delineamentos experimentais:

1) Mecanismos moleculares dos glicocorticóides endógenos (GE) na expressão de moléculas de adesão:

• Participação do receptor citosólico de glicocorticóides (GCR) na expressão de moléculas de adesão em neutrófilos (L-selectina e β2integrina) e

moléculas de adesão endoteliais (ICAM-1, PECAM-1, VCAM-1, E- selectina, P-selectina e VAP-1).

• Expressão gênica de L-selectina e moléculas da superfamília das imunoglobulinas;

• Translocação nuclear de NFκB em neutrófilos e células endoteliais; • Expressão de anexina A-1 em neutrófilos circulantes e da medula óssea; • Participação da anexina A-1 na expressão de L-selectina.

2) Mecanismos envolvidos na mobilização de neutrófilos da medula para o sangue periférico:

• Participação do GCR no número de leucócitos no compartimento medular e no sangue periférico;

• Participação da anexina A-1;

• Apoptose e necrose de neutrófilos circulantes; • Participação do eixo SDF-1α/CXCR4;

3) Efeito do ACTH ou dos níveis elevados de GE sobre o recrutamento de neutrófilos da medula para o sangue e sobre a expressão de moléculas de adesão:

• Número de neutrófilos no sangue e na medula óssea; • Expressão de moléculas de adesão em neutrófilos.

A seguir, estão descritos as espécies animais, tratamentos farmacológicos e cirúrgicos e as metodologias empregadas.

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3.2 Animais

Para a realização dos experimentos foram utilizados ratos Wistar machos (180-200g), fornecidos pelo Biotério da Faculdade de Ciências Farmacêuticas e do Instituto de Química da Universidade de São Paulo. Adicionalmente, foram utilizados camundongos machos Balb/C wild types (WT) ou knockouts (KO) para proteína anexina A-1, fornecidos pelo biotério do William Harvey Research Institute, The Barts and London, School of Dentistry and Medicine, Londres. Os animais foram mantidos em condições normais do biotério, com temperatura e umidade controladas, livre acesso à ração e água, até o início dos experimentos. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com os Princípios Éticos de Experimentação Animal adotados pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA-protocolo 20), FCF/USP e sob o guia de operações de animais do Reino Unido, regulamentado no Act 1986.

3.3 Procedimentos cirúrgicos

Adrenalectomia bilateral foi realizada em ratos, sob anestesia pelo cloridrato de ketamina (77mg/kg) /cloridrato de xilazina (7mg/kg) i.p., através de incisão cutânea e muscular bilateral, junto ao rebordo costal. No período pós-operatório foi oferecida solução salina fisiológica (cloreto de sódio 0,9%) aos animais. Animais falso-operados (FO) foram submetidos a incisões cirúrgicas e suturas equivalentes às praticadas nos animais adrenalectomizados (ADR). Os animais de ambos os grupos foram utilizados no 7º dia após as cirurgias.

3.4 Tratamentos farmacológicos 3.4.1 RU 38486

A sigla RU 38486 designa o esteróide sintético 17 -hidroxi-11 -(4-dimetil-

amino-fenil)-17α-(prop-1-enil)-estra-4,9-dien-3-one. Essa substância possui alta afinidade pelos receptores de glicocorticóides e progesterona atuando, exclusivamente, como antagonista dessas substâncias (MOGUILEWSKY & PHILBERT, 1984).

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O RU 38486 (Sigma, St.Louis, MO, USA) foi diluído em solução de etanol absoluto e salina fisiológica (1:1). Foi administrado em ratos normais na concentração de 10mg/kg, por via intraperitoneal (i.p.), a cada 24hs por um período de 7 dias. Animais controles receberam igual volume do veículo pela mesma via.

3.4.2 ACTH

O ACTH, hormônio adrenocorticotrófico, é um polipeptídio com trinta e nove aminoácidos e é produzido pelas células corticotróficas da adeno-hipófise. O ACTH atua sobre as células da camada cortical da glândula adrenal, estimulando-as a sintetizar e liberar seus hormônios, principalmente glicocorticóides.

Camundongos WT ou KO para anexina-A1 receberam pela via intraperitoneal 5ug de ACTH sintético (Synacthen® Depot, Novartis), em dose única, que foi diluído em tampão fosfato salina (PBS; NaCl 125mM, KCl 5mM, Na2HPO4 8mM, NaH2PO4

2mM). Animais controles receberam igual volume do veículo pela mesma via. Os animais foram sacrificados após 4hs do tratamento para realização dos ensaios.