TIPO DE ESTUDO: ESTUDO EPIDEMIOLÓGICO , CASO/ CONTROLO
Grupo em estudo: Doentes asmáticos da Consulta de Alergologia do CHLN- HSM; n=114 Grupo controlo: dadores de sangue saudáveis; n=50
Caracterização da amostra: A amostra é constituída por doentes asmáticos controlados e não controlados e grupo controlo de dadores de sangue saudáveis. Para uma potência de 90% e com p<0.05, com uma frequência alélica na população controlo de 30-40% e com OR >1.5 estima-se uma amostra que se aproxime dos 170-180 indivíduos104.
Consentimento informado: foi assinado por todos os doentes .
Os participantes são: o grupo controlo com 50 dadores voluntários de sangue, saudáveis, e 114 doentes asmáticos do Serviço de ImunoAlergologia do Hospital de Santa Maria-CHLN. O diagnóstico de asma foi classificado de acordo com as linhas de orientação do Global Initiative for
Asthma (GINA)105,tendo em conta a natureza episódica da dispneia, pieira, tosse, opressão torácica, frequência dos sintomas, limitação ou não da actividade diária, existência ou não de sintomas nocturnos, frequência das exacerbações, utilização de medicação de alívio, valor do FEV1 e PEF e variabilidade diária dos mesmos.
A definição de doentes com asma não controlada e de doentes com asma controlada foi realizada através da avaliação do nível de controlo da asma, por um instrumento validado: Asthma Control Questionnaire - ACQ7 O cut-point considerado é o da prática clínica 0.75 (para os que tiverem idade> 17 anos), e PAQLQ Pediatric Asthma Quality of Life Questionnaire–VERSÃO Portuguesa by Juniper (7-17 anos)(<4 implica asma não controlada)106 .
Esta avaliação foi realizada após a selecção dos doentes, e submissão a um período de 8 semanas (3 consultas) de optimização terapêutica de acordo com as linhas de orientação(guidelines) do
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GINA. Os doentes que ao fim destas 8 semanas mantiverem pelo menos um indicador de asma não controlada no último mês [utilização frequente da medicação de alívio, despertares nocturnos provocados pela asma, pieira/dispneia frequente com limitação das actividades diárias, exacerbações que motivaram recorrer ao Serviço de Urgência, FEV1 <80% e não haver melhoria ou piorar, o score (Asthma Control Questionnaire) - ACQ-7 ou PAQLQ], serão classificados como tendo asma não controlada. Os restantes doentes serão considerados como controlados.
Os critérios de exclusão são: os indivíduos que não aceitem participar no estudo; a não adesão à terapêutica anti-asmática (avaliada através do preenchimento do patient diary card-Asthma
Clinical Research Network); a existência de outras co-morbilidades que possam interferir na
gravidade da doença respiratória; a existência do diagnóstico de Doença Pulmonar Obstrutiva Crónica ou outra doença pulmonar; tabagismo; os doentes com infecção HIV, parasitados ou com outro tipo de infecção, com anemia, com insuficiência renal ou com doença hepática crónica. Todos os participantes asmáticos são caracterizados relativamente a variáveis sócio- demográficas (raça; sexo; idade; país de origem;local de residência; profissão; anos de escolaridade;), história clínica, longevidade da doença asmática , ausência de outra patologia pulmonar e outros critérios de exclusão; prova de provocação inalatória inespecífica com metacolina positiva ou prova de broncodilatação positiva ; testes cutâneos, IgE total, RAST e ISAC, FeNO
A condição de asma controlada e não controlada foi relacionada com: a) o tipo de alergenos a que estão sensibilizados Testes cutâneos em Prick realizados de acordo com as recomendações da Academia Europeia de Alergologia e Imunologia Clínica(EAACI) usando a bateria de alergenos da ALK-Abello. Soro salino como controlo negativo e histamina 10 mg/ml como controlo positivo.Os testes cutâneos são considerados positivos se pelo menos um alergeno tiver uma pápula com mais de 3 mm de diâmetro após subtracção do controlo negativo;- b) gravidade da asma (Intermitente e Persistente: ligeira/moderada/grave) conforme as normas do GINA para níveis de gravidade da asma após período de optimização terapêutica (Controlada/Parcialmente controlada/Não Controlada) ; c) classificação das exacerbações de asma segundo as normas do GINA (ligeira, moderada, severa e paragem respiratória iminente); d) FEV1 e PD20 na prova de provocação inalatória inespecífica com metacolina segundo as normas da ATS .A prova de provocação inalatória é realizada com metacolina, administrada através de um dosímetro
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M.E.F.A.R. MB3, com um débito de aerosol de 39μL/5 nebulizações, o doente inala cada concentração de metacolina 5 vezes seguidas desde o volume residual até à capacidade pulmonar total. A função respiratória é medida 3 minutos após a inalação de cada dose de metacolina através de manobras de expiração forçada com espirómetro. Considera-se o teste terminado quando pela primeira vez se medir uma redução de FEV1 ≥20% ou após a inalação da última dose de metacolina. A dose de metacolina que provocar uma redução do FEV1=20%(PD20 FEV1) é calculada através de interpolação linear dos dois últimos pontos da curva de dose-resposta.; e) níveis de IgE total medida por imuno-ensaio fluoroenzimático(Pharmacia, Uppsala, Sweden e específica RAST- Teste in vitro-RadioAlergoAbsorvente- para detecção de Anticorpos IgE específicos circulantes no soro-EIA(Imunoensaio) (Pharmacia, Uppsala, Sweden) ; f) Óxido nítrico no ar exalado-doseamento de óxido nítrico do ar exalado durante 6 segundos com Nioxmino .ADULTOS: Feno (ppb) < 5 ;5–25(Improvável);;; 25–50(Presente mas moderada); >50(significativa); CRIANÇAS: Feno (ppb) < 5 ;5–20(Improvável);;; 20–35(Presente mas moderada); >35(significativa)- g) consumo de beta2 miméticos de curta(Salbutamol; Terbutalina) e longa acção (Salmeterol; Formoterol) ; h) qual o corticóide inalado(Dipropionato de Beclometasona; Budesonido/ Budesonido suspensão prara nebulização;Fluticasona/Fluticasona nebules e dose; i) administração de anti-colinérgicos/Parasimpaticolíticos (Brometo de ipratrópio; tiotrópio) ; j) Metilxantinas (aminofilina; teofilina); l) antagonistas dos receptores dos leucotrienos(montelucaste;zafirlucaste) ; m)Corticóides orais(Prednisona; Prednisolona;Metilprednisolona; Deflazacort; Betametasona) ; n)Anticorpo monoclonal anti-IgE(IgG1k)(Omalizumab) ; o)existência(activa /no passado) ou não de imunoterapia específica;p)níveis de ECP no sangue periférico e contagem de eosinófilos.
A determinação do polimorfismo genético da haptoglobina é realizada a partir da Hp plasmática, por electroforese em gel de poliacrialmida (PAGE) 4,7% em solucão tampão TRIS-HCl 0.504M, pH 8.9. As amostras para aplicação no gel (10μL) são preparadas utilizando sacarose 40% (p/v), Hb 28,2mg/mL e plasma, na proporção de 3:2:4, para um volume final de 45μL. Para a coloracão das bandas resultantes da electroforese é usado o método da coloração por contacto, usando o- dianisidina 16mM em ácido acético 50% (v/v) e, posteriormente, peróxido de hidrogénio 0,6% (v/v).Os fenótipos de Hp são determinados por electroforese em gel de poliacrilamida, sendo-lhe atribuído o correspondente genótipo (Figura 20).
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Figura 20: Fenótipos da Haptoglobina em g
el de poliacrilamida
Os níveis de Haptoglobina são determinados por nefelometria- (BN ProSpec da Siemens Helthcare Diagnostics).
Avaliação estatística: Para determinar se a diferença entre os valores médios de haptoglobina é significativa entre os grupos, utilizou-se o teste t de Student para amostras independentes (paramétrico) ou o equivalente não paramétrico,Man-Whitney. Para estudar a associação entre níveis de Haptoglobina codificada e outras variáveis qualitativas, usou-se o teste do Qui-Quadrado, assim como para avaliar as diferenças entre frequências alélicas e de genótipos entre grupos. Para comparar os níveis de Haptoglobina entre os diferentes grupos definidos pelos genótipos utilizou- se um teste paramétrico ANOVA depois de verificados os pressupostos da normalidade e homogeneidade das variâncias e testes pos-hoc ou teste não paramétrico de Kruskal Wallis se os pressupostos do teste paramétrico não se verificarem. Para avaliar o risco (Odds ratio) de associação com os diferentes genótipos e de ter asma não controlada neste grupo de doentes, foi utilizada a regressão logística.
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Foi utilizado o software estatístico PASW versão 18 para análise estatística dos dados estabelecendo-se um nível de significância de p< 0.05.
NOME DA VARIÁVEL TIPO DE
VARIÁVEL METODOLOGIA ESTATÍSTICA
HAPTOGLOBINA QUANTITATIVA Análise Descritiva (média±sd)+boxplots.
Teste T Student para amostras independentes para comparar grupo controlo com asmáticos , ou equivalente não paramétrico Man-Whitney.
ANOVA para avaliar diferenças da Hp por genótipo por grupo e por idade codificada ou equivalente não paramétrico Kruskal Wallis
HAPTOGLOBINA CODIFICADA
Qualitativa Teste Qui-quadrado para avaliar a associação entre a hp e as restantes variáveis qualitativas.
Teste Qui-quadrado para avaliar as diferenças entre frequências alélicas e de genótipos entre grupos.
IDADE CODIFICADA Qualitativa
GÉNERO Qualitativa ASMA CONTROLADA/NÃO CONTROLADA Qualitativa ALERGIA(SIM/NÃO) Qualitativa GENÓTIPO Qualitativa ASMA CONTROLADA/NÃO CONTROLADA
Qualitativa Regressão logística para avaliar o risco de asma não controlada associada aos diferentes genótipos.
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