11 Conclusions
11.2 SIC and thermodynamic optimizations conclusions
polipropileno - Manuscrito submetido para Protein Expression
and Purification).
Eliminação de endotoxina de soluções protéicas é um dos passos mais desafiadores de purificação protéica, uma vez que a eficiência do protocolo varia com as propriedades físico-químicas de cada proteína. A maior parte dos procedimentos são caros, longos e com baixo rendimento protéico. Propomos aqui o uso de um método fácil, rápido e barato que pode ser executado na maior parte dos laboratórios do mundo. A metodologia vem da simples observação de que, depois da purificação protéica e preservação a 4°C em cones de 50 ml (Corning ou Falcon), o conteúdo de endotoxina diminui com o tempo. Depois de executar experimentos com FITC-LPS nos mesmos cones, observamos uma diminuição similar em fluorescência ao longo do tempo, levando-nos a acreditar
previamente descrito na literatura (65) (Dados não mostrados). Notamos, também, que depois que diminuíamos o pH para pH abaixo do fisiológico, a eficiência da eliminação de endotoxina de soluções protéicas era ainda maior, chegando a 99,9% em alguns casos. O rendimento protéico na maioria dos casos variava com o tratamento em diferentes pHs. As proteínas aqui testadas tiveram rendimento protéico que variava entre 60 e 97%, indicando que é necessário tentar diferentes pHs até que se encontre o pH mais adequado para a eliminação da endotoxina e a preservação do rendimento protéico.
Uma vez aplicado o método de eliminação de endotoxina nas proteínas aqui testadas, medíamos os níveis de endotoxina usando o método LAL. Esse método mostrou que níveis significativos de eliminação de endotoxina haviam sido atingidos. A extração de inibidores provenientes de tubos de polipropileno
(Figura 3 Anexo 2), assim como presença de β-glucana, são conhecidos como
inibidores do ensaio de LAL. Ambos os inibidores não foram detectados nos experimentos.
Testamos a atividade biológica e a qualidade da TAT-HO1 após a eliminação de endotoxina e percebemos um aumento da atividade biológica da proteína quando desprovida da endotoxina contaminante. A atividade biológica foi testada usando insulinoma β-TC3 tratado com TNFα, ciclohexamina e TAT- HO1 (31), na presença ou ausência de endotoxina (Tabela 1.3- Anexo 2). Isso mostra não só que a proteína TAT-HO1 permanecia biologicamente ativa, mas que também a endotoxina parecia estar contribuindo para a toxicidade celular (55). A qualidade da proteína TAT-HO1 foi analisada após eliminação de endotoxina, usando o sistema Agilent 2100 Bioanalyzer, e não se mostrou
diferente da mesma proteína com a presença de endotoxina. Isso indica que o tratamento em pH ácido não alterou o padrão protéico apresentado.
Como o nosso objetivo era atingir níveis de eliminação de endotoxina que fossem compatíveis com estudos in vivo, decidimos testar in vivo a pirogenicidade em coelhos das proteínas tratadas para eliminação de endotoxina. Nesse contexto, as proteínas seriam expostas ao sistema imunológico de um animal que é muito mais complexo que o ensaio in vitro de LAL.
O mesmo preparado protéico foi dividido entre dois grupos de coelhos: um grupo que recebeu a proteína com 20 EU/ml e o segundo que recebeu a proteína com 0,3EU/ml, após ser submetido ao protocolo de eliminação de endotoxina. O procedimento de eliminação de endotoxina mostrou-se eficiente
in vivo, confirmando os testes in vitro feitos com ensaio LAL. Já a proteína que
não foi submetida à retirada de endotoxina mostrou-se altamente pirogênica
(Figura 4 Anexo 2)
Não realizamos nenhum experimento mecanístico para desvendar como a eliminação de endotoxina acontece. Acreditamos que a adsorção pelo plástico polipropileno, assim como a mudança em pH fisiológico da proteína, exerça algum papel no processo de descontaminação. No entanto, experimentos futuros precisam ser feitos para elucidar essa questão.
Existe a possibilidade ainda de que não eliminamos a endotoxina da solução protéica, mas apenas induzimos uma mudança conformacional na estrutura da molécula, fazendo com que a porção correspondente ao lipídio A fique indisponível para detecção por meio do ensaio LAL. Ainda assim, é
improvável que essa mudança conformacional seja micela, uma vez que essa formação acontece em pHs básicos e não ácidos como foi o caso aqui descrito.
Em função da nossa preocupação com a possibilidade dessa mudança conformacional ser temporária e da possibilidade de haver nova organização da molécula de endotoxina uma vez dentro de um ambiente in vivo, decidimos executar experimentos in vivo em coelhos com proteínas que haviam sido submetidas à eliminação de endotoxina aqui descrita. Nossos resultados mostraram que a possível mudança conformacional era provavelmente permanente, uma vez que não havia pirogenicidade na proteína submetida à eliminação de endotoxina nem in vitro nem in vivo.
O método aqui descrito poderia ser usado em larga escala ou escala industrial se pequenas adaptações fossem incorporadas ao sistema. Uma idéia seria fazer microesferas do mesmo polipropileno usado nos tubos Corning e Falcon. Essas esferas poderiam ser usadas tanto em soluções contaminadas com endotoxina sob agitação como em colunas em que se poderia passar a solução para aumentar a exposição de superfície. Isso provavelmente aumentaria a eficiência e diminuiria o tempo de eliminação de endotoxina de soluções protéicas.
Concluindo, fomos capazes de desenvolver um método simples, eficiente, rápido e barato para eliminar endotoxina de proteínas recombinantes que nos permitiu proceder com a aplicação in vivo de diversas proteínas produzidas no nosso laboratório. É importante notar que o ajuste em pH deve ser feito para cada proteína a ser testada com esse método de eliminação de
endotoxina, com o objetivo de atingir máxima eliminação de endotoxina, juntamente com um nível de rendimento protéico aceitável.