General results

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4.1.

Coleta de sangue e isolamento celular

Neutrófilos foram isolados do sangue venoso periférico de cinco doadores voluntários da faixa etária entre 18 e 40 anos, que não apresentavam histórico de doenças crônicas ou alérgicas, inflamatórias ou quaisquer tipos de doenças que necessitem de uso periódico de medicação, não fumantes, e que não tivessem feito uso de bebidas alcoólicas pelo menos nas 48 horas anteriores à coleta. Dentro das especificações de higidez descritas acima, os doadores assinaram de um termo de consentimento livre e esclarecido. O procedimento foi executado mediante a aprovação pelo comitê de Ética da Universidade de Brasília (número de registro: CEP-CFM-45/2010), em conformidade com a Declaração de Helsinki.

A coleta do sangue foi realizada por punção venosa periférica utilizando seringa heparinizada (5UI/mL) (Brown, Lever et al. 2003). As células foram isolados utilizando a diferença de densidade das mesmas, através de um duplo gradiente contendo Percoll - 60% e 70% (Aquino, 2015), (GE Healthcare)- misturado a uma solução tampão HBSS modificada- contendo Cloreto de Potássio; Fosfato de Potássio monobásico; NaCl; Fosfato de Sódio dibásico; D-glicose; vermelho de fenol; Bicarbonato de sódio; água milli-Q; pH entre 7.2 e 7.4;Sigma Aldrich) para manter as condições fisiológicas das células durante todo o experimento. As densidades dos gradientes foram otimizadas e pré- estabelecidas para este experimento.

A montagem de um duplo gradiente foi feita em tubos falcon de polipropileno de 50mL (TPP), sendo que o sangue venoso foi adicionado sobre o duplo gradiente, já

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previamente montado, sendo utilizados para isso 12mL de cada componente (gradiente 60% e 70%; e sangue venoso), todas as soluções utilizadas para a etapa inicial do procedimento de isolamento encontravam-se a temperatura ambiente e esterilizadas usando filtro Millipore de 0.22um.

Após a montagem do gradiente, os tubos contendo o mesmo foram centrifugados a 200g por 15 minutos a temperatura ambiente; ao final do tempo de centrifugação, formaram-se várias fases. A região na parte superior do tubo correspondente plasma e células mononucleares foi descartada. Os neutrófilos encontravam-se na região entre os gradientes de 60 e 70%, o conteúdo total do halo de neutrófilos juntamente com parte do gradiente de 70% foi colhido para um tubo falcon novo para o procedimento de lavagem. As células foram submetidas a 2 lavagens com tampão HBSS 1x, e centrifugadas a 300g por 5 minutos para a retirada completa do percoll.

As hemácias residuais foram retiradas por lise hipotônica durante 15 segundos, e a osmolaridade do meio foi recuperada pelo uso de solução tampão de HBSS modificado na concentração 2X. O procedimento de isolamento é resumido na figura a17 e imagem de experimento em anexos.

Figura 16. Isolamento celular. O sangue

venoso foi coletado e depositado sob o duplo gradiente de densidade (representados em rosa). Seguido de uma centrifugação a 200g por 15 minutos. A etapa seguinte foi a coleta dos neutrófilos da região descrita em rosa no segundo falcon, seguidas de lavagens e lise de hemácias.

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Após o processo de lavagem, as hemácias residuais foram removidas por lise hipotônica (Neves, 2012). Os procedimentos descritos acima, exceto o isolamento, foram realizados em condições de baixas temperaturas; pois, neutrófilos são células que respondem prontamente a qualquer estímulo externo, e a extensiva manipulação celular em temperaturas fisiológicas poderia disparar processos de ativação basal nas células.

Avaliação pureza e viabilidade celular

A fim de avaliar de forma qualitativa e quantitativa as células que foram isoladas no procedimento anterior; então foram retiradas 3 alíquotas de 10ul cada para os procedimentos descritos a seguir.

A pureza do isolamento foi avaliada com a utilização da técnica de Citospin para a fixação das células em lamina , seguido da coloração das mesmas com o reagente em solução Wright (BIOCLIN), onde os 10 ul de suspensão de células foi aplicado sobre a superfície de uma lâmina e centrifugado a 300g. As células fixadas a superfície foram então coradas com o corante Wright, após a secagem da lâmina foram contadas 100 células, sendo utilizadas apenas as amostras que apresentavam a pureza acima de 98%.

A viabilidade das células foi avaliada em câmara de Neubauer, sendo utilizado o reagente azul de tripan como corante. O Azul de tripan é um reagente cristalino solúvel em água, que penetra em células que apresentam rompimento na parede celular, sendo então caracterizadas como células mortas as que apresentarem coloração azul no citoplasma. Para isso, foram contadas 100 células por campo, sendo aceita como suspensão de células viáveis apenas as que apresentaram acima de 97% de células vivas.

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Para a avaliação quantitativa, a alíquota de células foi ressuspendida em solução de Turk (composta por ácido acético glacial, azul de metileno e água destilada filtrada). Onde 10 ul dessa suspensão foi aplicada em uma câmara de Neubauer.

4.2.

O processo de ativação celular in vitro foi executado utilizando a concentração de 100 nmol/L de fMLP (Sigma F3506) com a duração de 30 minutos de incubação. O tempo de exposição do peptídio ao neutrófilos foi determinado em prévios experimentos executados no laboratório de bioquímica e química de proteínas (Dias, 2015). As células utilizadas nesses foram incubadas a temperatura de 37°C e 25°C por 30 minutos, (Botha, Moore et al. 1995). As duas temperaturas de ativação são descritas na literatura com temperatura de ativação para neutrófilos humanos. Ressaltando que a diferença de temperatura de ativação não foi alvo de comparação da análise e apenas entra como variável para expandir o número de proteínas encontradas pelo estímulo. A ideia de analisar duas temperaturas diferentes em um mesmo experimento foi comparar as diferentes informações da literatura, visando esclarecer melhor sobre a ativação em diferentes temperaturas.

O número de Neutrófilos utilizados nos experimentos de ativação foram alíquotas de no mínimo 3 x 106 _{células para espectrometria de massas, 2.5 x 10}5 _{células para as}

análise ortogonais de NBT, 3 x 106 _{citometria de fluxo e 1.5 x 10}6 _{microscopia eletrônica}

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