THE ROLE OF FAITH BASED ORGANISATIONS

Tem sido demonstrado que na presença de inibidores da síntese protéica, certos RNAm são acumulados, indicando que o bloqueio da síntese protéica pode revelar em qual estágio o controle da expressão gênica é exercida (Clayton & Shapira, 2007). Este efeito também foi identificado nos genes codificadores das proteínas de superfície: prociclina de T. brucei, TS e Tc85 de T. cruzi e a GP63 de L. (L.) chagasi (Graham & Barry, 1996; Abuin et al., 1999; Brittingham et al., 2001). Epimastigotas e tripomastigotas metacíclicos foram incubados na presença de cicloheximida durante 8 h. Após diferentes períodos de incubação, o RNA total foi extraído e os níveis de RNAm GP82 e GP90 foram determinados por hibridização em “northern blot”. A normalização foi feita após hibridização com RNAr 24Sα. Como mostra a figura 5, a adição da droga não teve efeito significativo na estabilidade dos RNAm GP82 (Fig. 5B) e GP90 (Fig. 5B) das formas metacíclicas quando comparado ao grupo controle, sem adição de cicloheximida. Por outro lado, em epimastigotas tratados com cicloheximida ocorreu um nítido aumento dos níveis de transcritos GP82 e GP90, 2,8 e 2 ×, respectivamente em comparação ao grupo controle (Fig. 6). Um efeito semelhante da cicloheximida foi descrito na estabilidade dos mensageiros dos genes TS e Tc85 nas formas de T. cruzi encontradas no hospedeiro vertebrado, onde os RNAm acumularam no estágio do parasita que precede aquele onde a estabilização acontece (Abuin et al., 1999). O mecanismo que promove a desestabilização dos transcritos GP82 e GP90 em epimastigotas pode ser devido à presença de fatores protéicos lábeis, cuja síntese foi inibida pela cicloheximida.

Para verificar se o efeito persistia mesmo após a remoção da cicloheximida, os epimastigotas foram novamente tratados com a droga durante 6 h a 28 °C. Após este período, os parasitas foram lavados com PBS por duas vezes e mantidos em meio LIT contendo 10 % de soro fetal bovino por até 12 h. O RNA total dos parasitas foi extraído nos intervalos indicados na figura 7 e hibridizado com sonda GP82 e, em seguida, re- hibridizado com sonda α-tubulina. Análise densitométrica mostrou que o RNAm GP82 volta ao seu nível basal (igual ao tempo 0 h) 4 h após a remoção da cicloheximida.

Tripomastigota Metacíclico A − 2,8 kb − 3,0 kb − 2,0 kb B 0 20 40 60 80 100 120 0 0,5 1 2 4 6 8 Tempo (h) ) 0 20 40 60 80 100 120 0 0,5 1 2 4 6 8 Tempo (h) I ) 0 200 0 0, 5 1 2 4 6 8 Controle Cicloheximida GP90 GP82 ntensidade de RNAm (% Intensidade de RNAm (%) Intensidade de RNAm (% Intensidade de RNAm (%)

Figura 5. Acúmulo dos transcritos GP82 e GP90 após tratamento de tripomastigotas metacíclicos com inibidor de síntese protéica. A) “Northern blot”

contendo RNA total de tripomastigotas metacíclicos tratados ou não com cicloheximida nos tempos indicados na figura. As hibridizações foram processadas seqüencialmente

com as sondas: J18 (GP82), MVar1 (GP90) e DNAr 24Sα (utilizada como controle). Os

tamanhos dos transcritos (em kb) estão indicados à direita. BrEt: brometo de etídio. B) Quantificação dos níveis de RNAm GP82 e GP90 a partir das imagens mostradas em A. As taxas dos transcritos GP82 e GP90 em relação ao RNAr 24Sα estão mostradas no gráfico à esquerda e à direita, respectivamente. Cada experimento foi repetido no mínimo três vezes com resultados similares.

Epimastigota A − 2,8 kb − 3,0 kb − 2,0 kb B 0 50 100 150 200 250 300 0 0,5 1 2 4 6 8 Tempo (h) ) 0 40 80 120 160 200 0 0,5 1 2 4 6 8 Tempo (h) ) 0 200 0 0, 5 1 2 4 6 8 Controle Cicloheximida GP90 GP82 Intensidade de RNAm (% Intensidade de RNAm (%) Intensidade de RNAm (% Intensidade de RNAm (%)

Figura 6. Acúmulo dos transcritos GP82 e GP90 após tratamento de epimastigotas com inibidor de síntese protéica. A) “Northern blot” contendo RNA

total de epimastigotas tratados ou não com cicloheximida nos tempos indicados na figura. As hibridizações foram processadas seqüencialmente com as sondas: J18 (GP82), MVar1 (GP90) e DNAr 24Sα (utilizada como controle). Os tamanhos dos transcritos (em kb) estão indicados à direita. BrEt: brometo de etídio. B) Quantificação dos níveis de RNAm GP82 e GP90 a partir das imagens mostradas em A. As taxas dos transcritos GP82 e GP90 em relação ao RNAr 24Sα estão mostradas no gráfico à esquerda e à direita, respectivamente. Cada experimento foi repetido no mínimo três vezes com resultados similares.

Figura 7. Restabelecimento dos níveis de RNAm GP82 após a retirada do inibidor de síntese protéica em epimastigotas. “Northern blot” contendo RNA total de epimastigotas tratados com cicloheximida (0, 3 e 6 h) e após a remoção da droga (2, 3 e 4 h). As hibridizações foram processadas seqüencialmente com as sondas: J18 (GP82) e α-tubulina (utilizada como controle). O tamanho de cada transcrito (em kb) está indicado à direita. CHX: cicloheximida; BrEt: brometo de etídio. O experimento foi repetido duas vezes com resultados similares.

4.4 Efeito da cicloheximida na transcrição de formas epimastigotas e tripomastigotas metacíclicas

A cicloheximida interfere no passo de translocação da síntese protéica, bloqueando assim a elongação do peptídeo. Com o bloqueio, fatores protéicos de vida curta são removidos da célula e não são repostos. Dois possíveis efeitos poderiam ocorrer. Primeiro, a ausência do fator que inibe a transcrição poderia levar ao aumento da transcrição do gene, e conseqüentemente, o aumento do nível do RNAm na célula. Segundo, o fator agiria na degradação de certos RNAm e sua ausência resultaria no acúmulo dos transcritos na célula.

Para investigar qual destas duas hipóteses explicaria o acúmulo dos transcritos GP82 e GP90, a transcrição em núcleos isolados foi analisada na presença de cicloheximida. Formas epimastigotas foram incubadas a 28 °C na presença ou ausência do inibidor de tradução durante 6 h (Fig. 8). Em seguida, os núcleos foram isolados e a síntese de RNA foi determinada na presença de [α-32

P] UTP. O RNA marcado foi hibridizado com “dot-blots” contendo os genes α-tubulina, DNAr 24Sα, Tc85, GP82 e GP90. Os níveis de hibridização com ambas as sondas foi similar, indicando que não houve aumento significativo na transcrição dos genes GP82 e GP90. A cicloheximida também não teve efeito na transcrição dos genes α-tubulina, DNAr 24Sα e Tc85. Novamente, nenhum sinal de hibridização foi detectado no “dot” contendo o plasmídeo pGEX. Este resultado indica que a droga não teve efeito na transcrição dos genes.

Figura 8. Análise da transcrição dos genes GP82 e GP90 na presença de cicloheximida (“run-on”). Formas epimastigotas foram incubadas a 28 °C na presença (+) ou ausência (-) de cicloheximida (CHX) por 6 h. Os núcleos foram isolados, utilizados em reações de “run-on” na presença de [α-32

P] UTP e hibridizadas com os seguintes genes T. cruzi: α-tubulina, rDNA 24Sα, Tc85-11, GP82 e GP90 e com o plasmídeo pGEX intacto (controle negativo da hibridização). À direita estão indicados os valores obtidos por quantificação no sistema Kodak. Na última coluna estão indicados os valores relativos do grupo tratado em relação ao não tratado. O experimento foi repetido duas vezes com resultados similares.

4.5 Distribuição dos transcritos GP82 e GP90 em diferentes compartimentos