Creating a conceptual arena

dados obtidos com os parasitas transfectados mostraram que a 3’-UTR tem pape

A GP82 depositados no b

e GP90 Os

l importante na regulação da expressão do gene GP82. Assim, investigamos a presença de cis-elementos que pudessem estar envolvidos neste processo. Uma primeira análise foi realizada na região 3’-UTR de clones de cDNA GP82 depositados no banco de dados e outros clones obtidos em nosso laboratório.

Até a presente data, existem apenas quatro clones de cDN

anco de dados que possuem a 3’-UTR. Todos eles correspondem a cDNAs isolados a partir de formas metacíclicas em nosso laboratório. Entre eles apenas o clone 5.4G6 (no. de acesso do “GenBank”: EF154827), isolado da cepa G, possui seqüência líder na sua extremidade 5’, sendo portanto um clone completo. Como já citado anteriormente, os clones L14824 e AF128843 foram isolados das cepas G e CL, respectivamente, e apresentam as seqüências da 3’-UTR com 96 % de identidade entre si. O quarto clone é o 5.2B5 (no. de acesso do “GenBank”: EF154828), que corresponde a um pseudogene GP82.

Outros clones 4C13, 4, 9, 24, 27 e 29 foram isolados em nosso laboratório de uma biblioteca de cDNA de tripomastigotas metacíclicos, seqüenciados e alinhados com os clones acima citados e com o “contig” genômico de CL Brener (no. de acesso do “GenBank”: AAHK01000705). A figura 20 mostra o alinhamento da 3’-UTR destas dez seqüências destacando as regiões ricas em adenilato e uridilato (AU). Foram identificadas duas regiões ricas em U, uma de 98 e outra de 108 nt, cada uma contendo uma cópia do pentâmero AUUUA previamente descrito em elementos ricos em AU (AREs), conhecidos por causar instabilidade do RNAm em eucariotos superiores (Chen & Shyu, 1995).

Comparando os clones de cDNA com o “contig” genômico verificamos que a 3’- UTR do clone L14824 é menor que as dos demais clones. Ela termina imediatamente antes de uma região rica em adenina [poli(A)] na seqüência genômica primária (Fig. 20). Embora o transcrito L14824 possa de fato representar um RNAm maduro, não podemos descartar a hipótese dele ser um artefato gerado pela técnica de RT-PCR, onde foi utilizado oligo (dT) para a síntese da primeira fita de cDNA. Neste caso, o oligo (dT) poderia ter hibridizado com a região rica em A do transcrito primário, gerando um cDNA incompleto. Os possíveis sítios de poliadenilação encontrados ocorrem principalmente onde há de quatro a dez resíduos de adenosina e estão localizados 83,

106 e 128 nt a montante de um trato de polipirimidina de 18 nt que pode ser o sinal de “trans-splicing” para o gene a jusante desta região (Fig. 21A). A distância deste trato de polipirimidina para o primeiro sítio aceptor de “trans-splicing” AG é de 14 nt. O comprimento do trato e a distância entre os sítios de processamento aqui analisados estão de acordo com aqueles propostos para T. brucei (Benz et al., 2005).

No caso dos transcritos GP90, foram comparadas as seqüências 3’-UTR de dois clones de cDNA isolados em nosso laboratório, T7 (L11287) e B19. Estes clones apresentam identidade de 94 % entre si e conteúdo AU igual a 60 %. Uma única cópia do pentâmero AUUUA foi encontrada (Fig.22A).

Em seguida, foi realizada a predição da estrutura secundária da 3’-UTR dos gene

mpos na 3’-UTR do RNAm GP82 (L14824 s GP82 e GP90 utilizando-se a versão 2.3 do programa mfold. (http://frontend.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/) (Mathews et al., 1999; Zuker, 2003). Esta versão permite variar a temperatura de “folding”, a qual foi padronizada para 28 °C, que é a temperatura na qual os epimastigotas e tripomastigotas metacíclicos são mantidas em meio de cultura axênico.

Foram preditos quatro e três gra ) e

GP90 (L11287), respectivamente. A probabilidade da formação destas estruturas secundárias é elevada, uma vez que são estáveis termodinamicamente, sendo o ∆G igual a -102,69 kcal/mol para 3’-UTR da GP82 e -171,38 kcal/mol para GP90 (Figs. 21B e 22B). Apesar das diferenças observadas nas seqüências da 3’-UTR do RNAm GP82, as estruturas preditas apresentaram conformações semelhantes àquela mostrada na figura 21B. O pentâmero AUUUA forma uma estrutura em alça do tipo “steam-loop” de fita única no RNAm GP82 (Fig. 21B).

igura 20. Alinhamento pelo programa Clustal W (DNAStar) da seqüência de nucle

F

otídeos da 3’-UTR de transcritos GP82 isolados de T. cruzi. Todos os clones foram isolados a partir de cDNA de tripomastigotas metacíclicos da cepa G, exceto o clone AAHK01000705 que é parte de um “contig” genômico do clone CL Brener. As caixas em vermelho destacam as regiões ricas em AU, o asterisco indica o códon de terminação dos clones e em verde estão sublinhados os motivos AUUUA presentes nesta região.

*

AUUUA AUUUA

Figura 21. Características da 3’-UTR do RNAm GP82. A. Seqüência do “contig” genômico (AAHK01000705) entre as regiões do códon de terminação da GP82 (asterisco) e o ATG (cinza) do próximo gene a jusante. Os triângulos invertidos indicam os possíveis sítios de poliadenilação dos clones alinhados na figura 20: T- clone L14824; T- clones 24 e 29; T- demais clones. O trato de polipirimidina está sublinhado e dois possíveis aceptores de “trans-splicing” (AG) encontram-se delimitados por caixas. Os nucleotídeos coloridos representam cada “loop” da 3’-UTR do clone L14824, mostrado em B. B. Estrutura secundária mais estável da 3’-UTR (L14824), predita pelo programa mfold. A caixa vermelha destaca a alça de fita simples “steam-loop”, onde se encontra o pentâmero AUUUA.

Figura 22. Características da 3’-UTR do RNAm GP90. A. Alinhamento dos clones T7 e B19 pelo programa Clustal W (DNAStar) da seqüência de nucleotídeos da 3’-UTR de transcritos GP90 isolados a partir de cDNA de tripomastigotas metacíclicos da cepa G de T. cruzi. O asterisco indica o códon de terminação dos clones e em sublinhado está o único motivo AUUUA encontrado nesta região. As caixas em vermelho destacam as regiões ricas em AU. As diferenças de nucleotídeos entre as seqüências estão destacadas em cinza. Os nucleotídeos coloridos representam cada “loop” da 3’-UTR do RNA GP90, mostrado em B. B. Estrutura secundária mais estável da 3’-UTR do clone T7 (L11287), predita pelo programa mfold.

4.8 Mapeamento dos genes GP82 e GP90 nas bandas cromossômicas da cepa G