cepa G, verificando-se que eles estão localizados em vários cromossomos e conseqüentemente dispersos no genoma (Araya et al., 1994; do Carmo et al., 2002). Apresentamos aqui uma análise mais detalhada após a definição do número e tamanho das bandas cromossômicas da cepa G em nosso laboratório. A cepa G possui 19 bandas cromossômicas cujos tamanhos variam de 0,60 a 2,69 Mb (Lima et al., dados não publicados) (Fig. 23A).
Neste trabalho, nos referimos como bandas cromossômicas às bandas separadas por eletroforese em campo pulsado (PFGE) e visíveis após coloração com brometo de etídio (Cano et al., 1995). A distribuição da fluorescência do brometo de etídio não é a mesma para todas as bandas, indicando co-migração de cromossomos não necessariamente homólogos. As bandas cromossômicas foram numeradas usando números arábicos (1 a 19), começando da menor banda de 0,60 Mb.
As bandas cromossômicas foram separadas por PFGE (Cano et al., 1995) e hibridizadas com sondas dos genes GP82 e GP90. A sonda MVar1 (AF426132) contém a fase de leitura aberta de uma das variantes do gene GP90 (do Carmo et al., 2002). Esta seqüência (2.179 pb) foi clonada por RT-PCR e contém a região 5’-UTR e 95 % da região codificadora do gene GP90. A sonda MVar1 hibridizou com 15 bandas com intensidade variável (Fig. 23B). As bandas cromossômicas 2, 3, 11, 13, 14 e 18 foram as que apresentaram maior intensidade no sinal de hibridização.
Em relação ao gene GP82 foram utilizadas três sondas: J18, que contém a fase de leitura aberta do gene e os oligonucleotídeos específicos ABI 8R e GP82 Rev. As sondas J18 e GP82 Rev hibridizaram 12 bandas, sendo 10 bandas reconhecidas pelas duas sondas. A sonda ABI 8R hibridizou com 10 bandas, todas também reconhecidas pela sonda J18. As intensidades das bandas variaram conforme a sonda utilizada, porém, as bandas 1, 3, 13 e 14 hibridizaram mais intensamente com as três sondas (Fig. 23). Das 15 bandas reconhecidas pela sonda MVar1, 13 também reagiram com pelo menos umas das sondas GP82. Este resultado pode ser devido a reação cruzada, uma vez que estes dois genes pertencem a uma família multigênica, cujos membros podem compartilhar seqüências semelhantes.
Figura 23. Mapeamento dos genes GP82 e GP90 nas bandas cromossômicas da cepa G de T. cruzi. A. Separação das bandas cromossômicas por corrida eletroforética em campo pulsado (PFGE) fotografado sob luz UV após incubação com brometo de etídio. À direita estão indicadas as bandas cromossômicas e à esquerda, seus respectivos tamanhos em megabases (Mb). B. Auto-radiogramas obtidos após a hibridação com as sondas GP90 (MVar1) e GP82 (J18, ABI 8R e GP82 Rev) indicadas abaixo da figura. Os números em azul e verde indicam a hibridização de bandas cromossômicas com uma e duas sondas GP82, respectivamente.
4.9 Organização nuclear dos genes GP82 e GP90
Sabendo que os genes GP82 e GP90 estão distribuídos em 12-15 cromossomos, respectivamente (Fig. 23), analisamos a distribuição destes genes no núcleo do parasita. Para alcançar este objetivo, foram realizados experimentos de hibridização in situ por fluorescência (FISH) em epimastigotas e tripomastigotas metacíclicos, utilizando como sonda os genes GP82 (J18) e GP90 (MVar1), as mesmas utilizadas nos experimentos de PFGE.
As imagens obtidas nos experimentos de FISH foram analisadas automaticamente pelo programa “DotsFinder” (Image Mining, IP-K), a partir de 61 imagens de 0,1 µm cada, obtidas em série Z. Após detecção e extração de cada par “núcleo-cinetoplasto“, a partir do sinal de DAPI, o programa passa a detectar os pontos dentro de cada núcleo. Ao final da análise, o programa fornece o número e a localização dos pontos (“dots”) encontrados em cada núcleo.
Como mostra a figura 24, os membros da família GP82 aparecem dispersos nos núcleos dos epimastigota (Fig. 24A) e tripomastigota metacíclico (Fig. 24B). O mesmo padrão de hibridização pode ser observado com o gene GP90 em ambas as formas (Fig. 25).
Na Tabela 2 estão indicadas as médias dos números de “dots” dos genes GP82 e GP90, as quais foram de 12 para epimastigotas e 13 para tripomastigotas metacíclicos. O número de “dots” encontrados corresponde exatamente ao número de bandas cromossômicas marcadas. Estes dados confirmam que cópias destes genes estão distribuídas em vários cromossomos. Novamente, não podemos excluir a possibilidade de hibridização cruzada, uma vez que os genes GP82 e GP90 apresentam certo grau de identidade entre si (40-60 %) e também com outros membros da superfamília TS.
Tabela 2. Quantificação do número de “dots” dos genes GP82 e GP90 obtidos pela técnica de FISH.
GP82 GP90 “Dots” por célula Células analisadas “Dots” por célula Células analisadas Epimastigota 12,4 (± 2,7) 10 11,4 (± 2,6) 5 Tripomastigota Metacíclico 13,0 (± 2,6) 5 12,8 (± 2,5) 13
A localização dos genes GP82 e GP90 foi determinada pela análise de mais de 400 “
a borda.
-se dispersos pelo núcleo nas duas formas estudadas, eles estão conc
dots” em epimastigotas e tripomastigotas metacíclicos. Após as distâncias terem sido calculadas pelo programa “DotsFinder”, os dados foram normalizados conforme representado no esquema abaixo. A distância em relação ao núcleo foi expressa em porcentagem, sendo zero (0) o centro do núcleo e um (1) a borda do núcleo. Por exemplo, um valor de distância igual a 0,6 significa que a posição do “dot” está 60 % distante do centro núcleo para
C B1 B2 D C- centro do núcleo D- “dot” Núcleo centro periferia 0 1 B- borda do núcleo
As freqüências de distância dos “dots” mapeados foram colocadas em gráficos do tipo histograma, mostrados na figura 26. Embora os “dots” dos genes GP82 e GP90 encontram
entrados nas áreas centrais. Além disso, há uma pequena diferença na distribuição entre os epimastigotas e tripomastigotas metacíclicos para os dois genes. Enquanto os tripomastigotas metacíclicos formaram uma linha de tendência simétrica, os epimastigotas formaram uma linha de tendência assimétrica, com um leve deslocamento para a esquerda (periferia do núcleo).
DAPI GP82 Merge A N K B N K
Figura 24. Localização dos genes GP82 pela técnica de FISH (“Fluorescence
in situ hybridization”). Epimastigotas (A) e tripomastigotas metacíclicos (B)
hibridizados com sonda do gene GP82 marcado com biotina (vermelho). O DNA do núcleo (N) e do cinetoplasto (K) foram corados com DAPI (azul). Barra: 2 µm.
DAPI GP90 Merge A K N B K N
Figura 25. Localização dos genes GP90 pela técnica de FISH (“Fluorescence
in situ hybridization”). Epimastigotas (A) e tripomastigotas metacíclicos (B)
hibridizados com sonda do gene GP90 marcado com biotina (vermelho). O DNA do núcleo (N) e do cinetoplasto (K) foram corados com DAPI (azul). Barra: 2 µm.
0 10 20 25 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 15 % 5 0 5 10 15 20 25 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 % 0 , 0 0 5 0 , 0 0
Epimastigota Tripomastigota Metacíclico
centro periferia
Figura 26. Dispersão dos “dots” de GP82 e GP90 nos núcleos de epimastigotas e tripomastigotas metacíclicos. Comparação da distribuição espacial de “dots” de GP82 (acima) e GP90 (a baixo) em epimastigota e tripomastigota metacíclico relativa ao centro de seus respectivos núcleos. O centro do núcleo é indicado pela posição zero (0). A seta indica como os “dots” estão distribuídos ao longo de núcleo. As linhas de tendência azuis e vermelhas indicam a distribuição dos “dots” em epimastigota e tripomastigota metacíclico, respectivamente.