8. DISCUSSION
8.1 L I DAR FOR ROCK MASS CHARACTERISATION
5.1. Sequenciamento de cDNA por Sanger
A integridade do RNA extraído foi verificada por meio de análise em gel de agarose 1% (Figura 22), onde foram observadas as duas bandas superiores, mais visíveis, correspondentes ao rRNA da subunidade maior do ribossomo (28S) e da subunidade menor (18S), respectivamente, uma vez que o RNA ribossomal ocupa a maior porcentagem do RNA total extraído. A última banda corresponde ao rRNA 5S. Figura 22: Gel de agarose 1% com RNA total da derme de P. distincta. 1-5: RNA total extraído da
derme de imago; 6-9: RNA total extraído da derme de adulto.
rRNA 28S rRNA 18S
rRNA 5S
6 7 8 9
A partir da análise do produto de PCR em gel de agarose 1%, observou-se a presença de fragmentos amplificados com cerca de 300 pb (Figura 23) na derme dorsal dos indivíduos adultos e na derme total extraída e pulverizada dos imagos. Na derme da região ventral do indivíduo adulto não se observou a presença de fragmentos amplificados. Os fragmentos foram isolados e purificados para a posterior clonagem com o kit pGEM-T. Os iniciadores PPS-1 e PPS-1A mostraram ser os mais efetivos para amplificação de fragmentos desejados, uma vez que amplificaram um maior número de fragmentos de cDNA extraídos da derme de imago, como também de adulto.
Figura 23: Análise em gel de agarose 1% de fragmentos amplificados do produto de PCR de cDNA
de P. distincta com cerca de 300pb com os primers PPS-1, PPS-1A, PPS-2 e PPS-2A. L-Marcador de peso molecular 1Kb. 1-4: Fragmentos de PCR obtidos da derme total de imago (indivíduo 1) (1-PPS- 1; 2-PPS-1A; 3-PPS-2; 4-PPS-2A). 5-8: Fragmentos de PCR obtidos da derme total de imago (Indivíduo 2) (5-PPS-1; 6-PPS-1A; 7-PPS-2; 8-PPS-2A). 9-12: Fragmentos de PCR obtidos da derme dorsal do indivíduo adulto (9-PPS-1; 10-PPS-1A; 11-PPS2; 12-PPS-2A).
O PCR de colônia revelou que o inserto desejado estava corretamente inserido nas colônias brancas e também revelou a ausência de resultados falso- negativos, conforme pode-se observar no gel de agarose da Figura 24.
Os plasmídeos foram submetidos ao sequênciamento automático de nucleotídeos, no qual foram obtidas, no total, 18 sequências nucleotídicas diferentes
300pb
300pb
L 1 2 3 4 5 6 7
em adultos e imagos contendo as características estruturais dos RNAs que codificam prepropeptídeos em anfíbios.
Figura 24:Eletroforese de gel de agarose 1% mostrando o inserto de 300 pb corretamente inserido nas células das colônias brancas e a ausência deste mesmo inserto nas células das colônias azuis em imago (L: Ladder 1Kb Plus; 1-13: Colônias brancas; 14-26: Colônias azuis).
O alinhamento das sequências de resíduos de aminoácidos que compõe os prepropeptídeos permitiu a classificação das sequências em três famílias distintas: triptofilinas, dermaseptinas e filoseptinas. A distribuição do número de peptídeos encontrados por família está representada na figura 25.
Figura 25: Distribuição das famílias de peptídeos encontradas com o sequênciamento de Sanger em
adultos e imagos.
300pb
L 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
As 18 sequências obtidas no total para indivíduos adultos e imagos, foram submetidas a uma busca por similaridade em dados presentes na literatura e em bancos de dados, o que permitiu concluir que quatorze sequências de peptídeos são inéditas e que as restantes quatro sequências já se encontram descritas na literatura, porém, em outras espécies do gênero Phyllomedusa. Deste modo, são inéditas em P. distincta.
Analisando as sequências de triptofilinas, foram obtidas três sequências inéditas. As sequências dos peptídeos maduros podem ser observadas na Tabela 2, bem como a sua distribuição pelas duas fases de desenvolvimento. Até ao momento, não haviam sido isoladas triptofilinas em P. distincta.
Tabela 2: Sequências do peptídeo maduro das triptofilinas encontradas por sequenciamento de
Sanger e a sua distribuição pelas duas fases de desenvolvimento.
Família de Peptídeo Peptídeo Maduro Imago Adulto
Triptofilina
EMPPGWMKGKK X X
EMPPGWIKGKSKI X
EWDGGKK X
Na figura 26 é possível visualizar o alinhamento destas sequências encontradas por sequenciamento de Sanger, bem como as respectivas preprosequências de cDNA.
Figura 26:A: Alinhamento das sequências de triptofilinas encontradas por meio do sequênciamento de Sanger com a sequência que codifica o prepropeptídeo com o respectivo peptídeo sinal, região acídica e peptídeo maduro. As setas indicam as zonas de clivagem. As sequências foram alinhadas com o programa Clustal W2 ; B, C e D: Sequências completas de cDNA que codificam os prepropeptídeos de triptofilina; as sequências sublinhadas correspondem ao peptídeo maduro.
MAFLKKSLFLVLFLGFVSISFC DEEKRPDNEEENESEQKREIHEEGNQEEKR EMPPGWMKGKK-- 63
MAFLKKSLFLVLFLGFVSISFC DEEKRPDNEEENESEQKREIHEEGNQEEKR EMPPGWIKGKSKI 65
MAFLKKFLFLVLFLGLVSISFC DEEKREEDEEENESEEKREIQEEGNQEERR E----WDGGKK-- 59
Peptídeo Sinal Região Acídica Peptídeo Maduro
A
ATGGCTTTCCTGAAAAAGTCGCTTTTTCTTGTACTATTCCTTGGATTAGTTTCCATTTCC M A F L K K S L F L V L F L G L V S I S TTCTGTGATGAAGAGAAAAGAAAGGAAGACGACGAGGAGAATGAGAGTGAGGAAAAGAGA F C D E E K R K E D D E E N E S E E K R GAAATTCAGGAAGAGGAAAATCAAGAGGAGAGAAGAGAATGGGATGGTGGAAAAAAGTAA E I Q E E E N Q E E R R E W D G G K K * ATGGCTTTCCTGAAAAAGTCGCTTTTTCTTGTACTATTCCTTGGATTTGTTTCAATTTCC M A F L K K S L F L V L F L G F V S I S TTCTGTGATGAAGAGAAAAGACCGGATAATGAGGAGGAGAATGAGAGTGAGCAAAAGAGA F C D E E K R P D N E E E N E S E Q K R GAAATTCATGAAGAAGGAAATCAAGAGGAGAAAAGAGAGATGCCTCCCGGTTGGATGAAG E I H E E G N Q E E K R E M P P G W M K GGAAAAAAGTAG G K K * ATGGCTTTCCTGAAAAAGTCGCTTTTTCTTGTACTATTCCTTGGATTTGTTTCAATTTCC M A F L K K S L F L V L F L G F V S I S TTCTGTGATGAAGAGAAAAGACCGGATAATGAGGAGGAGAATGAGAGTGAGCAAAAGAGA F C D E E K R P D N E E E N E S E Q K R GAAATTCATGAAGAAGGAAATCAAGAGGAGAAAAGAGAGATGCCTCCCGGTTGGATAAAG E I H E E G N Q E E K R E M P P G W I K GGAAAAAGTAAAATATAA G K S K I *
B
C
D
Na Tabela 3 encontram-se os peptídeos maduros das dermaseptinas encontradas, bem como a sua distribuição em adultos e imagos. No total, foram encontradas sete sequências de preprodermaseptinas, sendo que três já haviam sido encontradas na literatura. Estas, porém, foram encontradas em outras espécies do gênero Phyllomedusa, conforme detalhado na Tabela 3. As restantes quatro dermaseptinas encontradas mostraram-se inéditas, não havendo ainda registro delas nos bancos de dados.
Tabela 3: Sequências do peptídeo maduro das dermaseptinas encontradas por sequenciamento de
Sanger e a sua distribuição pelas duas fases de desenvolvimento, bem como a nomenclatura das três dermaseptinas já registradas na literatura.
Família de Peptídeo
Peptídeo Maduro Imago Adulto Nomenclatura* Referências
ALWKTLLKGAGKVFGHVAKQFLGSQGQPES X X DRS-S11 Amiche et al.,
2005
GLWSKIKAAGKAAGTAALKAAGKAALGAVSEAVGEQ X - -
Dermaseptina
GLWSKIKEAAKTAGKMGMGFVNDMVGEQ X - -
GLWSKIKAAGKAAGKMGMGFVNDMVGEQ X - -
ALWKDILKNAGKAALNEINQIVQGG X DRS-T4 Prates et al.,
2006
ALWKNMLKGIGKLAGQAALGAVKTLVGAE X DRS-B3 Charpentier et
al., 1998
ALWKTLLKGAGKVSGHVAKQFLGSQGQPES X - -
*A nomenclatura usada é de acordo com Amiche et al. (2008)
As preprosequências completas encontram-se realçadas na figura 27A, sendo que a primeira sequência corresponde à dermaseptina DRS-S11 (Amiche et al., 2005), já encontrada em P. sauvagii, a segunda corresponde à dermaseptina DRS- T4 (Prates et al., 2006), encontrada em P. tarsius, a terceira corresponde à dermaseptina DRS-B3 (Charpentier et al., 1998). Na figura 27B é possível visualizar a sequência de cDNA traduzida e o respectivo prepropeptídeo, correspondente à DRS-S11.
Figura 27: A: Alinhamento das sequências de dermaseptina encontradas por sequenciamento de
Sanger e alinhadas com o programa Clustal W2 com o respectivo peptídeo sinal, região acídica e peptídeo maduro. As setas indicam as zonas de clivagem; o realce em amarelo corresponde às dermaseptinas DRS-T4, DRS-B3 e à preprodermaseptina DRS-S11, respectivamente. B: Sequência completa de cDNA que codifica o prepropeptídeo DRS-S11; a sequência sublinhada corresponde ao peptídeo maduro de dermaseptina.
A
MAFKKKSLFRVLFLGLVSLTTC EEEKRENEDEENQEDDEQSEMKR GLWS-KIKEAAKTAG---KMGMGFVNDMVGEQ-73
MAFLMKSLFLVLFLGLVSLSIC EEEKRENEDEEEQEDDEQSEMKR GLWS-KIKAAGKAAG---KMGMGFVNDMVGEQ-81
MAFLMKSLFLVLFLGLVSLSIC EEEKRENEDEEEQEDDEQSEMKR GLWS-KIKAAGKAAGTAALKAAGKAALGAVSEAVGEQ-81
MAFKKKSLFRVLFLGLVSLTTC EEEKRENEDEMEQEDDEQSEMKR ALW----KDILKNAG---KAALNEINQIVQGG-69
MAFLKKSLFLVLFLALVPLSIC EEEKREEENEEKQEDDEQSEEKR ALWKNMLKGIGKLAG---QAALGAVKTLVGAE-74
MAFLKKSLFLVLFLGMVSLSIC EEEKRENKDEEEQEDDEQSEEKR ALWKTLLKGAGKVFG---HVAKQFLGSQGQPES75
MAFLKKSLFLVLFLGMVSLSIC EEEKRENKDEEEQEDDEQSEEKR ALWKTLLKGAGKVSG---HVAKQFLGSQGQPES75
B
atggctttcctgaaaaaatccctttttcttgtactattccttggaatggtctctctttct M A F L K K S L F L V L F L G M V S L S atctgtgaagaagagaaaagagaaaataaagatgaggaggaacaagaggatgatgagcaa I C E E E K R E N K D E E E Q E D D E Q agtgaagagaagagagctctgtggaaaactctattaaaaggtgcaggaaaggtgtttgga S E E K R A L W K T L L K G A G_ K V F G catgtggctaaacaatttctaggatcacaaggacaaccagaaagttaa H V A K Q F L G S Q G Q P E S *Foram encontradas oito sequências de filoseptinas, no total, em imagos e adultos (Tabela 4), sendo que seis são inéditas e uma já havia sido encontrada em P. sauvagii, correspondendo à preprofiloseptina S4 (Abassi et al., 2007). Contudo, este prepropeptídeo mostrou-se inédito em P. distincta, tendo sido sequênciado nos indivíduos imagos. Até ao momento, na literatura, ainda não haviam sido relatadas filoseptinas na secreção de P. distincta.
Tabela 4: Sequências do peptídeo maduro das filoseptinas encontradas por sequenciamento de
Sanger e a sua distribuição pelas duas fases de desenvolvimento, bem como a nomenclatura da filoseptina já registrada na literatura.
Família de Peptídeo
Peptídeo Maduro Imago Adulto Nomenclatura* Referências
FLSMIPHIVSGIASLANHLG X X - -
FLSMIPHIVSGVAALAKHLG X X - -
FLSMIPHIINGVAALVKHLG X - -
FLSMIPHIVNGVAALANHLG X - -
FLSMIPHIVSGVAALAHHLG X PLS S4 Abassi et al.,
2007
FLSMIPHIVSGVAALARHLG X - -
FFSMIPHIVSGIASLANHLG X - -
FFSMIPHIVSGVAALVKHLG X - -
* A nomenclatura usada é de acordo com Amiche et al. (2008)
Na figura 28A é possível visualizar o alinhamento das preprosequências completas, sendo que o realce em amarelo evidencia a filoseptina PLS S4. Na figura 28B encontra-se a sequência de cDNA e o respectivo peptídeo maduro de uma das filoseptinas inéditas.
Figura 28:A: Alinhamento das preprosequências de filoseptinas encontradas por sequenciamento de Sanger e alinhadas com o programa Clustal W2 com o respectivo peptídeo sinal, região acídica e peptídeo maduro. As setas indicam as zonas de clivagem. A sequência realçada corresponde à preprofiloseptina S4; B: Sequência completa de cDNA que codifica o prepropeptídeo filoseptina; a sequência sublinhada corresponde ao peptídeo maduro de filoseptina.
A
MAFLKKSLFLVLFLGLVSLSI CEEEKRETEKEEHDQEEDDKSEEKR FLSMIPHIVSGVAALAHHLG
MAFLKKSLFLVLFLGLVSLSI CEEEKRETEKEEHDQEEDDKSEEKR FLSMIPHIVSGVAALARHLG
MAFLKKSLFLVLFLGLVSLSI CEEEKRETEEEEHDQEEDDKSEEKR FLSMIPHIVSGIASLANHLG
MAFLKKSLFLVLFLGLVSLSI CEEEKRETEEEEHDQEEDDKSEEKR FFSMIPHIVSGIASLANHLG
MAFLKKSLFLVLFLGLVSLSI CEEEKRETEEEEHDQEEDDKSEEKR FLSMIPHIVSGVAALAKHLG
MAFLKKFLFLVLFLGLVSLSI CEEEKRETEEEEHDQEEDDKSEEKR FFSMIPHIVSGVAALVKHLG
MAFLKKSLFLVLFLGLVSLSI CEEEKRETENE---QEDDDKSEEKR FLSMIPHIINGVAALVKHLG
MAFLLKSLFLVLFLGLVSLSI CEEEKRETENE---QEDDDKSEEKR FLSMIPHIVNGVAALANHLG
B
atggctttcctgaaaaaatcgctttttcttgtattatttctcggactggtttccctttcc M A F L K K S L F L V L F L G L V S L S atctgtgaagaagagaaaagagagactgaagaggaagaacatgatcaagaggaagatgat I C E E E K R E T E E E E H D Q E E D D aaaagtgaagagaagagattcctcagcatgataccacatatagtatctggagtagctgcg K S E E K R F_ L S M I P H I V S G V A A cttgctaaacatttaggttaa L A K H L G * 5.2. PirossequenciamentoUm total de 934.307 sequências foram analisadas no sequenciamento do cDNA dos indivíduos imagos e adultos. Destas, 30.769 não reuniram os critérios mínimos de qualidade de acordo com o SeqClean script e foram descartadas. As restantes 903.538 sequências foram usadas para uma análise mais detalhada (Tabela 5). Cerca de 1,1% das sequências totais obtidas correspondem a sequências de rRNA, o que indica que o enriquecimento das amostras em mRNA foi satisfatório.
Tabela 5: Dados comparativos relativos ao pirossequenciamento das bibliotecas de cDNA dos
indivíduos imagos e adultos.
Número de sequências por biblioteca
Biblioteca de cDNA de indivíduos metamórficos
Biblioteca de cDNA de indivíduos adultos
Número total de sequências analizadas
502,782 431,525
Número total de sequências limpas
472,984 430,554
Sequências descartadas* 29,798 971
Tamanho médio das sequências (pb)
358,71 377,30
* Sequências descartadas devido à sua baixa qualidade, ruído ou tamanho insuficiente. .
Foram encontradas, no total, nove sequências de peptídeos que se enquadram na família de dermaseptinas, sendo que quatro dessas sequências são a dermaseptina S-12 (DRS-S12) encontrada em P. sauvagei, a dermaseptina D-I1 (DRS-DI1) encontrada em P. distincta, a dermaseptina S-11 (DRS-S11) também encontrada em P. sauvagei e a dermaseptina T-4 (DRS-T4) encontrada em P. tarsius. Contudo, não foram encontradas as dermaseptinas DI2, DI3, DI4 e DI5 já descritas em P. distincta. As restantes cinco sequências mostraram ser inéditas na literatura e bancos de dados. A tabela 6 mostra a distribuição das dermaseptinas encontradas no pirossequenciamento do cDNA dos indivíduos imagos e adultos.
*A nomenclatura usada é de acordo com Amiche et al. (2008)
Na figura 29 é possível ver o alinhamento das preprosequências completas de dermaseptinas encontradas com o pirossequenciamento.
Família de Peptídeo
Peptídeo Maduro Imago Adulto Nomenclatura* Referências
ALWKTLLKGAGKVFGHVAKQFLGSQGQPES X X DRS-S11 Amiche et al., 2005 GLWSKIKAAGKAAGTAALKAAGKAALGAVSEAVGEQ X - GLWSKIKEAGKSVLKAAGKAALGAVTDAVGEQ X - Dermaseptinas GLWGKIKEAGKVLKAAGKAALGAVTDAVGEQ X - GLWSKIKAAGKAAGTAALKAAGKAALGAVSQAVGEQ X - GLWSKIKAAGKAAGTAALKAAGKAAFNAAVPAAF X - ALWKDILKNAGKAALNEINQIVQGG X DRS-T4 Prates et al., 2006 GLWSKIKEAAKTAGKMAMGFVNDMVGEQ X DRS-S12 Amiche et al., 2005
GLWSKIKAAGKEAAKAAAKAAGKAALNAVSEAVGEQ X DRS-DI1 Batista et
al., 1999
Tabela 6: Distribuição das sequências de dermaseptinas relativas ao peptídeo maduro encontradas
no pirossequenciamento da biblioteca de cDNA dos indivíduos imagos e adultos, com os respectivos nomes.
Figura 29: Alinhamento das nove preprosequências de dermaseptinas encontradas por
pirossequenciamento e alinhadas com o programa Clustal W2 com o respectivo peptídeo sinal, região acídica e peptídeo maduro. As setas indicam as zonas de clivagem. As sequências realçadas correspondem aos peptídeos já descritos na literatura.
MSFLKKSLFLVLFLGLVSFSICC EEEKRESEDEEKQEDDEQSEMKR GLWSKIK----EAGKSVLKAAGKAALGAVTDAVGEQ--- 78
MSFLKKSLFLVLFLGLVSFSIC -EEEKRESEDEEEQEDDEQSEMKR GLWGKIK----EAGK-VLKAAGKAALGAVTDAVGEQ--- 76
MAFLKKSLFLVLFLGLVSLSIC -EEEKRENEDEENQEDDEQSEMRR GLWSKIK----EAAK---AGKMAMGFVNDMVGEQ--- 72 DRS-S12
MAFLKKSLFLVLFLGLVSLSIC -EEEKRENEDEEDQEDDEQSEEKR GLWSKIKAAGKEAAKAAAKAAGKAALNAVSEAVGEQ--- 81 DRS-DI1
MAFLKKSLFLVLFLGLVSLSIC EE-EKRENEDEEEQEDDEQSEMKR GLWSKIKAAGKAAGTAALKAAGKAALGAVSEAVGEQ--- 81
MAFLKKSLFLVLFLGLVSLSIC EEKEKKRNEDEEEQEDDEQSEMKR GLWSKIKAAGKAAGTAALKAAGKAALGAVSQAVGEQ--- 82
MAFLKKSLFLVLFLGLVSLSIC --EEKRENEDEEEQEDDEQSEMKR GLWSKIKAAGKAAGTAALKAAGKAAFNAAVPAAF--- 78
MAFKKKSLFRVLFLGLVSLTTC -EEEKRENEDEMEQEDDEQSEMKR ALWKDIL---KNAGKAALNEINQIVQGG--- 70 DRS-T4
MAFLKKSLFLVLFLGMVSLSIC -EEEKRENEDEEEQEDDEQSEEKR ALWKTLL---KGAGKVFGHVAKQFLGSQGQPES 75 DRS-S11
Por meio da curadoria das sequências, foram também encontrados quatro prepropeptídeos inéditos. Estes receberam o nome de dermacisteínas. Observando o peptídeo maduro, verifica-se que a porção N-terminal se assemelha às dermaseptinas já descritas e apresentadas na Tabela 6, contudo a porção C- terminal é diferenciada. Outra diferença é relativa à existência de vários resíduos de cisteína, conforme realçados na Tabela 7. Também é possível visualizar que essas dermacisteínas foram encontradas unicamente nos indivíduos imagos, apresentando um padrão comum entre elas.
Na figura 30 encontra–se o alinhamento das preprosequências completas de dermacisteínas encontradas por pirossequenciamento.
Tabela 7: Distribuição das sequências de dermacisteínas relativas ao peptídeo maduro encontradas
no pirossequenciamento da biblioteca de cDNA dos indivíduos imagos. Em realce amarelo encontram-se os resíduos de cisteína.
Peptídeo Maduro Imago Adulto
GLWSKIKSSRKSCRNSCIKSCRKSSFRCSFSSGRRAIKLVKCKLNHIALRSTLINNYVKSILK X
GLWSKIKAAGKSCRNSCIKSCRKSSFRCSFSSGRRAIKLVKCKLNHIALRSTLINNYVKSILK X
GLWSKIKQQEKLQDSCIKSCRKSSFRCSFSSGRRAIKLVKCKLNHIALRSTLINNYVKSILK X
GLWSKIKAAGKAAGTAALKSCRKSSFRCSFSSGRRAIKLVKCKLNHIALRSTLINNYVKSILK X
Figura 30: Alinhamento das preprosequências de dermacisteínas encontradas por
pirossequenciamento e alinhadas com o programa Clustal W2 com o respectivo peptídeo sinal, região acídica e peptídeo maduro. As setas indicam as zonas de clivagem.
MAFLKKSLFLVLFLGLVSLSIC EE-KRENEDEEEQEDDEQSEMKR GLWSKIKSSRKSCRNSCIKSCRKSSFRCSFSSGRRAIKLVKCKLNHIALRSTLINNYVKSILK 107
MAFLKKSLFLVLFLGLVSLSIC EE-KRENEDEEEQEDDEQSEMKR GLWSKIKQQEK-LQDSCIKSCRKSSFRCSFSSGRRAIKLVKCKLNHIALRSTLINNYVKSILK 106
MAFLKKSLFLVLFLGLVSLSIC EE-KRENEDEEEQEDDEQSEMKR GLWSKIKAAGKSCRNSCIKSCRKSSFRCSFSSGRRAIKLVKCKLNHIALRSTLINNYVKSILK 107
MAFLKKSLFLVLFLGLVSLSIC EE-KRENEDEEEQEDDEQSEMKR GLWSKIKAAGKAAGTAALKSCRKSSFRCSFSSGRRAIKLVKCKLNHIALRSTLINNYVKSILK 107
MAFLKKSLFLVLFLGLVSLSIC EEEKRENEDEEDQEDDEQSEEKR GLWSKIKAAGKEAAKSCSKSCRKSGFKCSF--- 75
Foram encontradas três sequências de prepropeptídeos com características semelhantes a dermorfinas, todas elas nos indivíduos adultos. Estas seguem um padrão repetitivo em tandem onde porções da região acídica e do peptídeo sinal se repetem, contudo, separados por um sítio de clivagem –KR. Na Tabela 8 encontra- se o peptídeo maduro das sequências encontradas. O prepropeptídeo completo encontra-se no Apêndice B.
Com relação ao pirosequenciamento de cDNA em indivíduos adultos, foi também encontrado um prepropeptídeo com características semelhantes a dermatoxina, porém, não descrito ainda na literatura. Este pode ser visualizado na Tabela 9.
Tabela 8: Distribuição das sequências de dermorfinas relativas ao peptídeo maduro encontradas no
pirossequenciamento da biblioteca de cDNA dos indivíduos adultos.
Família de Peptídeo Peptídeo Maduro Imago Adulto
Dermorfina
YAFGYPLRRS x
YAVGHPSGEDQKNK X
YAFGYPSGEA X
Também no pirossequenciamento do cDNA dos indivíduos adultos, foram encontradas duas bradicininas, conforme mostrado na Tabela 10. Contudo, não foram encontradas bradicininas expressas nos imagos.
Tabela 10: Sequência do prepropeptídeo de bradicininas encontradas no pirossequenciamento do
cDNA dos indivíduos adultos. O realce amarelo corresponde ao peptídeo maduro.
Com relação às filoseptinas, foram encontradas cinco sequências por pirosequenciamento, bem como duas sequências de prepropeptídeos relacionadas a esta família de peptídeos e designadas de filocisteínas. Observando a Tabela 11, verifica-se que esta família de peptídeos possui a porção N-terminal semelhante a filoseptinas, contudo, a porção N-terminal se diferencia, sobretudo pelo fato de possuir resíduos de cisteína terminais. Estas foram encontradas apenas no pirossequenciamento do cDNA dos indivíduos metamórficos.
Família de
Peptídeo Peptídeo Maduro Imago Adulto
Dermatoxina MAFLKQSLFLVLFLGLVPLSLCENEKREGENEEEQDDDQSEEKRSLGGFLKGVGNVVAGVGKVVAD X
Tabela 9: Sequência do prepropeptídeo de dermatoxina encontrado no pirossequenciamento do
cDNA dos indivíduos adultos. O realce amarelo corresponde ao peptídeo maduro.
Família de
Peptídeo Peptídeo Maduro Imago Adulto
Bradicinina
MSFLKKSLFLVLFLGLVSFSICEEEKRDTEEEENDDEIEEESEEKKREAPERPPGFTPFRIY x
*A nomenclatura usada é de acordo com Amiche et al. (2008)
Na figura 31 é possível visualizar o alinhamento das preprosequências completas das filoseptinas encontradas.
Figura 31: Alinhamento das preprosequências de filoseptinas encontradas por pirossequenciamento
e alinhadas com o programa Clustal W2 com o respectivo peptídeo sinal, região acídica e peptídeo maduro. As setas indicam as zonas de clivagem.
MAFLKKSLFLVLFLGLVSLSIC EEEKRETEEEEHDQEEDDKSEEKR FLSMIPHIVSGVAALAHHLG 66
MAFLKKSLFLVLFLGLVSLSIC EEEKRETEKEEHDQEEDDKSEEKR FLSMIPHIVSGVAALD---- 62
MAFLKKSLFLVLFFGLVSLSIC EEEKRETEEEEHDQEEDDKSEEKR FLSMIPHIVSGVAALAKHLG 66
MAFLKKSLFLVLFLGLVSLSIC EEEKRETEEEEHDQEEDDKSEEKR FLSMIPHIVSGIASLANHLG 66
MAFLKKSLFLVLFLGLVSLSIC EEEKRETENE---QEDDDKSEEKR FLSMIPHIINGVAALANHLG 63
Tabela 11: Distribuição das sequências de filoseptinas e de filocisteínas relativas ao peptídeo maduro
encontradas no pirossequenciamento da biblioteca de cDNA dos indivíduos imagos e adultos. Em realce amarelo encontram-se os resíduos de cisteína.
Família de Peptídeo
Peptídeo Maduro Imago Adulto Nomenclatura* Referências
FLSMIPHIINGVAALANHLG X X
Filoseptina FLSMIPHIVSGIASLANHLG X X
FLSMIPHIVSGVAALAKHLG X X
FLSMIPHIVSGVAALAHHLG X PLS-S4 Abassi et al.
2007
FLSMIPHIVSGVAALD X
Filocisteína FLSMIPHIVSGIASLANHFTICGIMLRNLFTC X
FLSMIPHIVSGVAALC X
O pirossequenciamento revelou também a presença de triptofilinas. Foram encontradas quatro sequências inéditas de prepropeptídeos com características relativas a esta família, conforme mostrado na Tabela 12.
Tabela 12: Peptídeos maduros de triptofilinas encontrados no pirossequenciamento do cDNA dos
indivíduos imagos e adultos.
Família de Peptídeo Peptídeo Maduro Imago Adulto
EMPPGWMKGKK X X
Triptofilina EMPPGWMKGKSKI X
EMPPGWMKGKKVKYNISEEQQLSEMVQKID X
EWDGGKK X
Na figura 32 encontram-se as preprosequências de triptofilinas encontradas e o respectivo alinhamento.
Figura 32: Alinhamento das preprosequências de triptofilinas encontradas por pirossequenciamento e
alinhadas com o programa Clustal W2 com o respectivo peptídeo sinal, região acídica e peptídeo maduro. As setas indicam as zonas de clivagem.
MDFLKKSLFLVLFLGFVSISFC DEEKRPDNEEENESEQKREIHEEGNQEEKR EMPPGWMKGKS---KI-
MDFLKKSLFLVLFLGFVSISFC DEEKRPDNEEENESEQKREIHEEGNQEEKR EMPPGWMKGKK---
MDFLKKSLFLVLFLGFVSISFC DEEKRPDNEEENESEEKREIHEEGNQEEKR EMPPGWMKGKKVKYNISEEQQLSEMVQKID
MAFLKKFLFLVLFLGLVSISFC DEEKREEDEEENESEEKREIQEEGNQEERR E----WDGGKK---
Observando as sequências de triptofilinas encontradas (tabela 12), verifica-se que estas mostram similaridades com duas famílias de peptídeos: triptofilinas e bradicininas. Analisando o peptídeo MPPGWMK com o C-terminal amidado, é possível inferir que este exibe um maior grau de semelhança estrutural com as bradicininas de peixes e, mais recentemente, com a bradicinina isolada do anuro Rana esculenta (Chen et al., 2011). Isso se evidencia pela presença de um
resíduo de aminoácido polar na região N-terminal e C-terminal e, sobretudo pela conservação do segmento Pro-Pro-Gly-Trp (Figura 33).
Figura 33: Alinhamento de sequências de bradicininas de peixes juntamente com o peptídeo inédito
encontrado em Phyllomedusa distincta. (*) Refere-se à amidação. Alinhamento múltiplo gerado pelo programa Clustal W2.
Sequência primária NR Espécie
RPPGWSPFR 9 Amia calva RPPGWSPFR 9 Lepisosteus osseus RPPGWSPLR 9 Danio rerio RPPGWSPLR 9 Rana esculenta RPPGWSPLR 9 Esox lucius