B EST PRACTICES FOR CONDUCTING GEOLOGICAL SURVEYS

Plantas transgênicas expressando moléculas antimicrobianas têm um grande potencial de proporcionar resistência contra diferentes patógenos, com capacidade de reduzir a dependência a agrotóxicos, o que, portanto, justifica os esforços para o desenvolvimento de metodologias e otimização nesta área (JAN et al., 2010; JHA et al., 2009; LIU et al., 2013; RONG et al., 2013).

Para a expressão heteróloga de um dado AMP é necessário primeiramente levar em consideração qual é o melhor sistema de expressão dependendo para qual finalidade da expressão (MAKHZOUM et al., 2014). No nosso caso a escolha da expressão em plantas é justificada devido à característica da Cp-tionina II que além de ter sido isolada de plantas, apresenta em sua estrutura terciária quatro pontes dissulfeto, modificação pós-traducional esta que pode ser realizada pela maquinaria plantas (TREMBLAY et al., 2011). Já a escolha da espécie Nicotiana tabacum refere-se à utilização de um organismo modelo, além do que, este peptídeo foi descrito apresentando atividade contra o fitopatógeno Pseudomonas syringae (FRANCO et al., 2006), de modo que foi adquirido um isolado desta bactéria do patovar Nicotiana tabacum.

A expressão da Cp-tionina II em um sistema vegetal torna-se de grande relevância, o que resultaria em plantas resistentes ou tolerantes ao fitopatógeno em questão. Além disso, ainda conseguiríamos obter informações adicionais sobre o comportamento deste peptídeo que pouco se conhece na literatura, por expressá-lo em um sistema modelo (KEYMANESH et al., 2009). Considerando a eficiência do peptídeo testado em uma planta modelo, este posteriormente poderia ser testado em outras plantas de interesse econômico tais como tomate e alface.

O nível de expressão de proteínas heteróloga em plantas, de modo geral é baixo em relação aos outros sistemas como procariotos e leveduras (JACKSON et al., 2014; MAKHZOUM et al., 2014) resultando muitas vezes em um nível pouco significativo de expressão (ATNASEO, 2011). Vários trabalhos na literatura discutem formas de otimizar diferentes questões, tanto relacionado a hospedeiro, a construção (cassete de expressão) e as metodologias para que o nível de expressão possa ser significativo a ponto da planta transformada podem apresentar potencial

aplicação biotecnológica (MOHAMMADZADEH et al., 2014; STREATFIELD, 2007; ULLRICH et al., 2015).

Há um consenso na literatura quanto aos aspectos que devem ser levados em consideração para uma otimização da expressão (AGARWAL et al., 2014; BATTELLI et al., 2014; LI et al., 2007; WEVER et al., 2010; ZHOU et al., 2013). Gustafsson e colaboradores (2004) sugere a manipulação do codon usage para a espécie a qual o peptídeo seria expresso como um ponto a ser levado em consideração, apesar deste não ser o mais relevante.

Neste trabalho embora não estivesse disponível a sequência de nucleotídeos original da Cp-tionina II, a otimização dos códons foi determinada levando em consideração a preferência de códons por N. tabacum.

Li e colaboradores (2007) realizaram experimentos utilizando duas estratégias de otimização do codon usage para expressão da proteína cry Bt em Arabidopsis thaliana. Em uma primeira estratégia foi escolhido o códon mais frequentemente utilizado para cada aminoácido em Arabidopsis. E uma segunda estratégia onde se manteve a diversidade de códons, mas sem a utilização dos códons raros. Após a expressão da proteína em questão, foi observado consistentemente que a segunda estratégia (diversidade de códons) obteve um melhor nível de expressão quando comparado com a primeira, apesar de ambas as construções das duas estratégias estarem sendo controladas pelo promotor CaMV35S. Demostrando que apesar da escolha dos códons mais comuns para a espécie, ainda assim há uma preferência pela diversidade de códons. Porém, esta “otimização” quando não bem planejada pode acabar por prejudicar a expressão da proteína (GUSTAFSSON et al., 2004).

Além da otimização dos códons preferenciais outros fatores podem interferir na expressão de proteínas heteróloga em plantas (BUTAYE et al., 2004; MOHAMMADZADEH et al., 2014; SEO et al., 2014). Para Makhzoum e colaboradores (2014) as características do cassete de expressão, tais como: promotores, sequências terminadoras, marcadores (tags), peptídeos sinal além de outros, deveriam ser consideradas para o aumento da expressão do gene ao nível da transcrição e tradução, acúmulo de proteína, estabilidade, retenção e direcionamento a organelas específicas.

Foram desenhados neste trabalho três cassetes de expressão todos sob controle transcricional do promotor CaMV35S (vírus do mosaico da couve flor). Apesar de existir uma diversidade de promotores descrito na literatura (SAHOO et al., 2014), o CaMV35S tem sido a escolha para controle da expressão constitutiva em mais de 80% das plantas dicotiledôneas geneticamente modificadas até o momento (AGARWAL et al., 2014).

Pelo fato de o promotor CaM35S ser capaz de controlar a expressão heteróloga em uma variedade de plantas, a sua utilização no desenvolvimento de plantas geneticamente modificadas para aplicações de pesquisa e agronômicas tornou-se generalizada (HULL et al., 2000). No entanto, estudos feitos por Bhullar e colaboradores (2009) sugerem que apesar do promotor 35S ser extensivamente usado para expressão de transgênicos no tecido aéreo das plantas, ele conduz uma expressão 2 a 3 vezes mais forte em raízes.

Apesar do nível mais elevado de expressão obtida para algumas plantas, diversos trabalhos na literatura indicam alguns efeitos negativos do promotor CaMV35S. Estes seriam decorrentes da presença de potenciais sítios de metilação, ponto de acesso para a recombinação e vários domínios com diferentes especificidades de tecidos, promotor eficiente que pode funcionar em uma gama de organismos, não só em plantas, mas também em bactérias e animais o que pode levar a questões de biossegurança (HO et al., 1999). Em vista disso diversos estudos, visam à prospecção e otimização de outros promotores que seja mais eficientes que o CaMV35S e que não apresente características que possam vir a prejudicar a expressão (SAHOO et al., 2014; ZHOU et al., 2013).

Yoo e colaboradores (2005) descrevem que a utilização do promotor CaMV35 como regulador para o gene de seleção pode afetar o padrão de expressão da proteína de interesse. Muitas vezes este promotor é escolhido para assegurar uma forte expressão, mas pode levar a uma interpretação equivocada dos resultados obtidos a partir de plantas transgênicas e alteração do fenótipo em alguns casos. Isso indica que as sequências potenciadoras do CaM35S localizadas na região do T- DNA podem influenciar no controle de ativação da expressão do transgene.

Outro aspecto que pode ser levado em consideração é a presença de peptídeos sinais que podem ajudar no aumento da estabilidade e proteção de uma

proteína contra degradação, uma vez que este sinal pode direcionar a proteína para uma organela especifica (MAKHZOUM et al., 2014).

A presença destas moléculas pode resultar no aumento do nível de expressão, devido ao destino final do peptídeo, como exemplo, a cecropina B expressa em arroz. Neste trabalho, em questão ao cassete de expressão desse peptídeo, foi adicionado também um peptídeo sinal da chitinase do arroz, para que o peptídeo de interesse pudesse ser secretado no espaço intercelular. Neste trabalho fez-se a comparação do peptídeo livre (cecB) e com a fusão da cecropina B com o peptídeo sinal (SP-cecB). A construção que possuía o peptídeo sinal mostrou distintos níveis de transcrição em diferentes linhagens transgênicas independentes, com um nível de expressão de moderado a alta do gene cecropina B (SHARMA et al., 2000).

Porém, como relatado por Florack e colaboradores (FLORACK et al., 1995) a fusão do AMP a um peptídeo sinal não é garantia de detecção da proteína. Utilizando construções com o gene da cecropina B tanto para expressão no citosol ou para a secreção em plantas de tabaco, os níveis de mRNA foram detectados em maior concentração em plantas transformadas com a construção que possuía o peptídeo sinal, porém em nenhum dos casos o peptídeo cecropina B foi detectado.

Neste trabalho todas as construções apresentam a sequência do peptídeo sinal Kappa (mouse kappa light chain signal sequence). Esta sequência codifica um peptídeo sinal para direcionamento para o RE, e posteriormente, na ausência de um sinal de retenção ao reticulo (K/HDEL), direciona a proteína ao apoplasto.

O apoplasto é uma região mais exposta ao ataque de enzimas proteolíticas comparado às organelas, mas por outro lado é a primeira região de ataque de patógenos e consequentemente a primeira linha de defesa do organismo invadido (WITZEL et al., 2011). Sendo a Cp-tionina II um provável agente de defesa, devido a sua atividade in vitro comprovada contra o patógeno Pseudomonas syringae, sua presença no apoplasto torna-se essencial, de modo que o invasor seria imobilizado.

Também são relatados peptídeos sinais que direcionam para locais de endereçamento mais específicos como é o caso dos compartimentos sub-celulares como reticulo endoplasmático (RE), mitocôndrias, vacúolos e cloroplasto. O RE é

considerado um local apropriado devido à presença de moléculas chaperonas e proteínas isomerase dissulfeto que além de facilitar a dobragem correta da proteína conduz ao aumento da estabilidade e acumulo de proteína (ATNASEO, 2011). Neste trabalho a construção pCambia2300·K·CptioninaII·Kdel, possui na região C- terminal uma sequência sinal KDEL que retém o peptídeo no RE. Esse direcionamento permite além das modificações pós-traducionais, acúmulo em um só local, com a minimização da possibilidade de degradação por enzimas proteolíticas por se tratar de um local relacionado à síntese proteica (LIU et al., 2011; NADAL et al., 2012).

A estabilidade causada pelo local de armazenamento foi relatada em um experimento que demonstra influencia do sinal KDEL. Neste trabalho em questão Stoger e colaboradores (1999) relataram que houve um aumento do nível de uma proteína de 6 a 14x quando comparada a mesma proteína sem a presença do sinal de direcionamento. Battelli e colaboradores (2014) mostraram que um gene da isolado a partir de petalas de Lillus longiflorum (LICYP) foi transcricionalmente regulada, de forma que plantas expressando LlCYP sem a sequência KDEL mostraram redução do crescimento e senescência precoce, quando comparadas a expressão da LICYP com o KDEL.

Um estudo que evidencia a importância dos peptídeos sinais foi publicado por Ramires e colaboradores (2002) que elaborou quatro construções contendo a sequência do antígeno de superfície da antivírus Hepatite B (anti-Hepatitis B virus surface antigen), porém direcionadas para diferentes locais: citossol, apoplasto, RE e vacúolos em Nicotiana tabacum. Após ensaios imunoenzimáticos com ELISA foram observados diferentes níveis de expressão de acordo com o local de endereçamento. Os ensaios foram realizados com o extrato de proteínas totais obtendo 0,031% (Apoplasto), 0,032% (vacúolo), 0,22% (RE) e não havendo detecção no citossol.

A fusão de AMP com outras proteínas é sugerida para maximizar a acumulação de AMP, protegendo-os de degradação pós-tradução, bem como limitando a sua toxicidade para a planta hospedeira (ATNASEO, 2011; MEIYALAGHAN et al., 2014). Gil e colaboradores (2001) apresenta a expressão da

proteína 2l21 fusionada ao gene repórter GUS, de modo que a expressão foi mais estável e aumentou o acumulo da proteína fusionada.

Alguns pontos que podem ser utilizados para otimizar a expressão, que foram desde manipulação por codon usage, até a presença de peptídeos sinais, tanto direcionada para o RE, Kappa e posterior liberação para o apopasto (todas as construções), ou com a retenção no RE devido à presença do peptídeo sinal KDEL (pCambia2300·K·CptioninaII·Kdel). Com relação às construções desenhadas neste trabalho não integramos proteínas de fusão, apenas há uma cauda de histidina na porção N-terminal da construção pCambia1300·K·6H·EK·CptioninaII, sendo que está foi usada como ferramenta para detecção, por meio do anticorpo anti-histag, no entanto por se tratar de uma molécula pequena, estes tags normalmente não tem efeito de estabilização (VIANA et al., 2013).

As construções foram utilizadas para transformação de Nicotiana tabacum, mediada por Agrobacterium, como resultado da transformação as plantas regeneradas (F0) geralmente abrigam apenas uma cópia de T-DNA (região que é transferida e integrada no genoma da planta) em um só local, o qual geralmente é herdado como herança mendeliana simples, dominante (PARK et al., 2015), de acordo com a lei de Mendel de segregação independente, onde a descendência derivada de autopolinização deveria mostrar um esperado de 3:1 (WEINHOLD et al., 2013). Neste estudo, não foram realizados análises estatísticas para confirmar o esperando da segregação (3:1) nas plantas F1 das linhagens equivalente a construção pCambia1300·K·6H·EK·CptioninaII, no entanto, durante os ensaios de atividade feitos com essa geração foram realizadas PCR e a proporção revelou uma segregação com níveis próximos da relação 3:1. Com relação às construções pCambia2300·K·CptioninaII pCambia2300·K·CptioninaII·Kdel não foi analisado a segregação, uma vez que ao término deste trabalho as sementes (F1) das plantas transformadas estavam em processo de germinação.

Após confirmação da integração do cassete de interesse no genoma da planta, as plantas permaneceram na casa de vegetação para obtenção da progênie. Como descrito nos resultados várias metodologias foram utilizadas na tentativa de detecção do peptídeo antimicrobiano. Para a detecção do peptídeo Cp-tionina II foram testadas três técnicas (Western-blot, ELISA e espectrometria de massa).

Independente da metodologia ou da construção avaliada não houve a detecção. A ausência da detecção pode estar relacionada a níveis baixos de expressão comumente observados em plantas transformadas (VIANA et al., 2013). Porém em uma das técnicas utilizadas (nanoLC-MSE), a detecção ocorre ao nível de femtomoles (fmol) segundo Murad e colaboradores (2011), e mesmo com essa sensibilidade não houve detecção.

Plantas contendo o gene da CP tionina II, conforme detecção por PCR foram imediatamente testadas quanto à presença do peptídeo através de análises proteômicas, não tendo sido avaliada a presença e quantidade de copias do gene de interesse por técnica de Southern-blot ou a presença de mRNA referente ao transgene por northern-blot ou qPCR. Entretanto, como as analises de expressão da proteína heteróloga foram negativas, abriu-se um leque de questionamentos sobre quais os prováveis motivos para a não detecção da Cp-tionina II.

A primeira questão a ser levantada é o fato que diferentes plantas transformadas, mesmo que com a mesma construção, o sítio de integração em localizações cromossômicas é diferente. Isto leva a uma grande variação na expressão do gene de interesse, sendo eventos de transformação independentes (BHULLAR et al., 2009). Assim cada linhagem positiva pode ter um comportamento diferente, e os motivos para a não detecção podem também ser diferentes. Muitas são as causas que resulta no silenciamento de gene, isso vai desde o local de integração do T-DNA até degradação da proteína do citoplasma (MATZKE e MATZKE, 1998; NELSON e MILLAR, 2015)

Em uma visão geral dos experimentos, foi feita a confirmação da integração do gene de interesse por PCR, porém não foi detectada a proteína. Entre esses dois extremos há uma lacuna com muitas possibilidades, incluindo a presença do mRNA. Assim a técnica de RT-PCR tornou-se uma opção conveniente uma vez que a detecção da presença do transcrito poderia confirmar a transcrição do gene. Assim, foi realizada um RT-PCR com quatro amostras coletadas aleatoriamente de cada construção, Após a reação de PCR foi visualizado em algumas linhagens o fragmento equivalente a uma parte da sequência do Kappa até o final da sequência da Cp-tionina II utilizando o cDNA como template.

A ausência da detecção do mRNA em algumas plantas pode está relacionado a duas questões: (I) uma via molecular referindo-se ao silenciamento do gene (discussão a seguir) ou (II) apenas por falhas no desenho experimental.

Outra questão levantada foi relativa à integridade do RNA total extraído, visto que esta etapa pode comprometer a qualidade/integridade do cDNA em etapas subsequentes. Desta forma é importante que se realize uma PCR utilizando um par de primers para amplificar um gene endógeno que apresente íntrons em sua sequência primária (DNA), uma vez que após o processamento do RNA (splicing) seu tamanho é menor (DIEFFENBACH e DVEKSLER, 2003). A reação de PCR utilizando este par de primers responderia duas questões: a primeira relacionada à contaminação com DNA-genômico, onde o produto da reação resultaria em fragmentos de tamanhos diferentes indicando a presença de contaminantes onde a fragmento amplificado a partir do DNA genômico resultaria em um amplicon de tamanho maior que o esperado caso houvesse a amplificação a partir do cDNA e a segunda a confirmação da integridade do RNA com a amplificação de outro gene.

Com relação às linhagens cuja presença do transcrito não foi detectada, os motivos podem estar relacionados ao silenciamento transcricional ou mesmo a região de integração do T-DNA, além da possibilidade de erro experimental. Já para as linhagens 11.3HIS; 29.1HIS; 64.1APO e 29.1KDEL, a presença do transcrito foi confirmada e a questão para a não detecção do peptídeo vai desde o silenciamento pós-transcricional até a instabilidade da proteína após o processo de tradução.

Silenciamento de RNA é um dos principais mecanismos de defesa adaptativa contra transposons, patógeno e transgenes (SOITAMO et al., 2011). Em eucarioto e particularmente em plantas, o silenciamento de RNA desempenha um papel importante, vinculando dinamicamente a mudança das respostas ambientais de expressão genica por meio do silenciamento do gene na transcrição (TGS) ou silenciamento gênico pós-transcricional (PTGS) (BOUHOUCHE et al., 2011; PUMPLIN e VOINNET, 2013).

Muitos estudos vêm sendo desenvolvidos com o intuito de uma melhor compreensão sobre os processos moleculares e o papel biológico do silenciamento de RNA em plantas (EAMENS et al., 2008). Um dos primeiros relatos do fenômeno que posteriormente foi denominado silenciamento gênico foi em meados dos anos

90, quando Matzke e colaboradores (1989) introduziram dois transgenes (duas regiões de T-DNA) no genoma de N. tabacum. Observou-se o silenciamento de um dos T-DNA, todavia este silenciamento só acontecia quando ambos T-DNAs estavam presentes. A inativação do transgene foi correlacionada com a metilação da sequência do promotor de modo que o os autores sugeriram que a similaridade compartilhada entre as duas sequências (promotor nos) poderia ter sido o gatilho para a metilação de um dos T-DNA. Correlacionado com as construções desenhadas neste trabalho existem sequências similares, uma vez que há a presença de dois promotores CaMV35S no cassete de expressão um regulando o gene de seleção e outro o gene da Cp-thioninia II.

Vários estudos foram realizados ao longo dos anos para o melhor entendimento sobre essas interferências na expressão do transcrito, desde o silenciamento do gene ocorrer quando o sistema da planta entende erroneamente um transgene introduzido ou o seu produto como parte de RNA de um vírus invasor (RATCLIFF et al., 1997) até mecanismos mais avançados como a associação desse silenciamento a pequenas moléculas de RNA (siRNA- 21 a 24 nucleotídeos) (EAMENS et al., 2008; HAMILTON e BAULCOMBE, 1999; JAGTAP et al., 2011; VAUCHERET, 2006).

Outras questões que podem ser levadas em consideração são: taxas de segregação incomuns, resultando no silenciamento em alguns eventos (WEINHOLD et al., 2013), número de cópias do transgene integrado ao genoma, a força do promotor de expressão (NOCAROVA et al., 2010), encerramento inesperado da transcrição ou mesmo a não poliadenilação do pré-RNA (WEINHOLD et al., 2013).

Correlacionando estes dados da literatura com resultados obtidos neste trabalho, podemos observar que apesar da maioria das possibilidades levantadas para explicar a não detecção do peptídeo seja viável, há a necessidade de mais experimentos. Todas as observações anteriores foram elaboradas considerando-se o processamento de transcrição. No entanto, outro fator que deve ser levado em consideração, principalmente devido à confirmação da presença do transcrito, é a estabilidade do peptídeo.

Segundo Atnaseo (2011) o fracasso na a produção de nível elevado de proteínas heteróloga pode ser explicado por vários fatores relacionados ao processo

de tradução ou na degradação da proteína em questão ou combinação destes dois fatores. Obembe e colaboradores (2011) propõem que o mais importante obstáculo para expressão é a perda da estabilidade o que resulta na degradação. Isso porque como visto por Doran (2006) as estratégias de otimização da produção heteróloga podem aumentar o nível de RNA mensageiro, no entanto, há um limite no aumento da quantidade de proteína acumulada, sugerindo que a transcrição do gene não é o principal obstáculo.

Owens e Heutte (1997) relata que a degradação é um dos vários fatores que podem afetar o nível de acumulação de transgenes em plantas, sendo que as proteases podem ser apontadas como um dos maiores fatores responsáveis pelo baixo acumulo de proteínas heteróloga. Isto porque essas proteínas heteróloga produzidas por plantas podem diferir de seus homólogos em termos de dobradura e estrutura de ordem superior, o que os torna mais vulneráveis a atividades de proteases (DESAI et al., 2010).

Nelson e Millar (2015) descrevem que as modificações que influenciam as características de populações de RNA mensageiro, tais como o comprimento da cauda poli A e o estrutura secundária pós-transcricional, contribuem para a regulação da síntese de proteínas. E as modificações pós-traducionais tais como a fosforilação, a ubiquitinação e processos não enzimáticos, regulam a taxa de degradação.

Owens e Heutter (1997) desenvolveram (sintetizaram) uma molécula análoga a Cecropina B para comparar à suscetibilidade de ambas as proteínas à degradação in vitro a partir do fluido intercelular de folha de várias culturas. Ao analisarem a meia vida do MB39 (análogo da cecropina B) a variação da degradação dessa proteína foi inesperada, a meia vida passou de apenas 3 minutos para batata até 25,5 horas em