As linhagens das plantas PCR-positivas foram transferidas para casa de vegetação para melhor desenvolvimento e obtenção da progênie (sementes) e durante este período foram feitos procedimentos para extração de proteínas para detecção do peptídeo Cp-tionina II expresso nas plantas de tabaco transformadas.
Plantas transformadas pelas três diferentes construções foram analisadas para a detecção da proteína. Uma folha (aproximadamente 1 grama) foi coletada e macerada utilizando um almofariz e pistilo em nitrogênio líquido. De acordo com o método de detecção que seria utilizado as proteínas tiveram um tratamento diferente, foram usados três protocolos com tampões diferentes, após a maceração;
Tampão 1: Adicionou-se o tampão 1:1 (tampão fosfato-® (PBS); PMSF 2mM; NaCl 20mM e DTT 10mM) e posteriormente centrifugadas a 8000g por 40 min, e o sobrenadante usado para Western-blot ou ELISA.
Tampão 2: Este tampão foi descrito por Franco e colaboradores (2006) no trabalho de isolamento da Cp-tionina II. As folhas foram maceradas com o tampão 0,1% HCl; 150mM NaCl pH~3 colocadas sob agitação em câmara fria overnight e posteriormente centrifugado por 40 minutos a 8000g. O sobrenadante foi precipitado com 60% de sulfato de amônia overnight e em seguida centrifugado por 30 minutos a 8000g, dialisado contra água destilada em membrana com cut-off de 3 KDa. Após a dialise o conteúdo foi liofilizado e ressuspendido em agua destilada.
Tampão 3: Este tampão foi utilizado para as análises das amostras em espectrômetro de MASSA. Discos foliares das plantas foram maceradas com tampão de fosfato de sódio 20mM pH7.0; DTT 1mM; tween20 0,1%; PMSF 1mM e NaCl 100mM. As amostras posteriormente formam centrifugadas a 8000g por 15 min e
precipitada com quatro volumes de acetona (100%) overnight, deixadas sob agitação em câmara fria, posteriormente foram centrifugadas a 8000 g por 10 min.
Para detecção do peptídeo Cp-tionina II produzido de forma heteróloga em plantas transgênicas referente à construção pCambia1300·K·EK·6HCp-tioninaII utilizamos três técnicas: Western-blot. ELISA e espectrometria de MASSA. Para as construções pCambia2300·K·CptioninaII e pCambia2300·K·CptioninaII·Kdel apenas a técnica de espectrometria de MASSA poderia ser utilizada, uma vez que não apresentava por exemplo um tag para detecção por Western-blot ou ELISA.
5.8.1. Western-blot
A detecção de proteínas foi feita por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE (LAEMMLI, 1970). As seguintes concentrações foram utilizadas: o gel separador a 15 % (Acrilamida 29%; Bisacrilamida 0,8%, Tris-HCl 1,5M pH 8,8; SDS 10%; persulfato de amônio 10% e Temed 0,2%) e o gel concentrador a 5% (Acrilamida 29%; Bisacrilamida 0,8%, Tris-HCl 0,5M pH 6,8; SDS 10%; persulfato de amônio 10% e Temed 0,2%). A eletroforese foi de acordo com as seguintes condições: 15 mA, 70 V, em tampão de corrida (Tris-base 125 mM; glicina 960 mM; SDS 0,5 %).
Após a eletroforese, foi realizada a transferência semi-seca das proteínas para uma membrana de PVDF (Immobilon P) A transferência foi feita a 15V e 200mA por 30 minutos, em tampão de transferência (Tris-base 48 mM; glicina 39mM; SDS 1,3mM e Metanol 20%). Para a imunudetecção, o bloqueio dos sítios inespecíficos da membrana foi utilizado 3% de albumina sérica bovina (BSA) em PBS por 1 hora sob agitação. A seguir, a membrana foi incubada com anticorpo monoclonal anti-His conjugado com fosfatase alcalina (1:5000 em 1% BSA em PBS tween 0,1%), por 1 hora sob agitação. Após este período a membrana foi lavada sob leve agitação em PBS por 30 min, com a troca do tampão a cada 10 minutos. Para a detecção da atividade da fosfatase alcalina utilizou-se em solução de revelação NBT/BCIP incubando-se a membrana em tampão de revelação segundo o recomendado pelo fabricante do revelador.
5.8.2. Ensaio imunoenzimático direto - ELISA
Outra metodologia utilizada para tentar a detecção do peptídeo nas plantas transformadas com a construção pCambia1300·K·EK·6HCp-tioninaII foi à técnica de ELISA pelo método direto usado como agente de revelação à enzima fosfatase alcalina.
Discos foliares foram coletados de uma planta de cada linhagem macerados em tampão PBS (1:1) 200 µl do extrato bruto foi adicionado, em triplicatas, à placa de 96 poços (High bond), sendo incubada por 1 hora a 37°C, para decantação das proteínas. Após este período, descartou-se o conteúdo dos poços e adicionou uma solução para bloqueio dos sítios inespecíficos com BSA 2,5%, deixando por 1 hora a 37°C. A solução foi novamente descartada e foram realizadas 3 lavagens da placa com tampão PBS. Posteriormente foi adicionada a solução contendo o anticorpo anti-His-tag conjugado com fosfatase alcalina diluído 5000x em solução de BSA 1 %, incubando por 1 hora a 37°C. Fez-se novamente a lavagem com PBS com Tween 20 (0,01%), por 3 vezes, seguida de uma lavagem com PBS para retirada do Tween, Em seguida foi preparada a solução para revelação usado o substrato para o anticorpo com fosfatase alcalina. O resultado foi obtido pela leitura da absorbância em espectrofotômetro com filtro de 405 nm.
5.8.3. Espectrometria de MASSA
Os extratos das plantas transformadas foram preparadas para a aquisição por 2D NanoUPLC-HDMSE de acordo com Murad e colaboradores (2011). Ao precipitado de proteínas foi adicionado 50μl de 50mM bicarbonato de amônio (NH4HCO3) e 25μl do surfactante RapiGest™ SF - Waters (0,2% v/v). As amostras
ficaram sob agitação e posteriormente foram aquecidas a 80°C por 15 min. Em seguida, as proteínas foram reduzidas pela adição de 2,5μl de 100mM DTT, homogeneizada por agitação e aquecida a 60°C por 30 min. Após isso 2,5μl de 300 mM iodoacetamida foi adicionado à amostra, misturadas e incubadas por 30 min à temperatura ambiente e protegidas da luz enquanto ocorria a alquilação das amostras.
Para a digestão tríptica adicionou-se 10μl da solução de tripsina (Promega®- 400 μl de 50mM bicarbonato de amônio por 20 μg de tripsina) homogeneizar por
agitação incubá-las a 37°C overnight. Para interromper a digestão de clivagem e precipitação do surfactante foram adicionados 10 μl de TFA (ácido triofluoracético - 5% v/v) deixando as amostras homogeneizando e incuba-las novamente a 37°C por 90 min. Após essa etapa, as amostras foram centrifugadas a 14.000 g, durante 30min. a 10 °C. O sobrenadante foi transferido para um novo microtubo de 1,5 mL. 50 µl desse sobrenadante foi coletado e adicionado a um vial juntamente com 10 µl de enolase e o volume ajustado para 200 µl com a solução H2O:Acetronitrila (97:3) e
0.1% de Ácido fórmico. Os peptídeos trípticos foram analisados pelo sistema nanoACQUITY™ (Waters Corp USA) com tecnologia 2D de fase reversa dupla acoplado ao espectrômetro de massa Synapt G2 HDMS™ (Waters, Manchester, UK).