I NSTRUMENT CHARACTERISTICS

6.1.1 Vetor pDonr·K·6H·EK·Cp-tioninaII (vetor de clonagem)

Inicialmente foi idealizada a obtenção dos vetores de transformação utilizando a técnica de clonagem Gateway®, baseada em recombinação, de fácil aplicação e alta eficiência. Para isso foi necessária à clonagem do gene Cp-tionina II que foi obtido pelo processo de digestão com as enzimas SalI/ SacI (figura 11) a partir do vetor pBS-K, em um vetor comercial apropriado para clonagem pelo sistema Gateway®.

Foi realizada uma digestão com as enzimas XhoI/SalI do vetor pDonr207 (pDonr207·K·6H·EK·, esquema do vetor figura 9). Este vetor contém além dos sítios de recombinação para Gateway®, outras sequências como o peptídeo sinal Kappa (K), um sítio de clivagem para enteroquinase (EK) e uma cauda de histidina (6H) que pode ser utilizada para detecção do peptídeo utilizando as técnica de Western-blot ou ELISA.

Figura 11 :Digestão do vetor pBs-K·Cp-tionina II SalI/SpeI. Gel de agarose com brometo de etídeo evidenciando os fragmentos DNA sob luz UV. M1: Marcador de peso molecular 1 Kb ladder Plus (Invitrogen®); 1: Digestão do vetor pBs-K·Cp-tionina II com as enzimas de restrições SalI e SacI, liberando o fragmento de 160 pares de bases que corresponde a Cp-tionina II.

Um dos clones obtidos após a transformação desta construção foi digerido com SalI e SacI para confirmar a presença do inserto. Nesta digestão foi liberado um fragmento com o tamanho esperado de 220 pb pares de bases (figura 12), sendo ainda a identidade da sequência confirmada por sequenciado (Macrogen, Coréia).

Figura 12: Digestão pDonr207•K•6H•EK•Cp-tioninaII SalI/SacI . Gel de agarose corado com brometo de etídeo evidenciando os fragmentos DNA após digestão sob luz UV. M: Marcador de peso molecular 1 Kb ladder Promega®; 1: Digestão do clone 1 do pDonr207•K•6H•EK•Cp-tioninaII com as enzimas de restrição SalI/SacI, apresentado um fragmento de 220 pares de bases equivalente ao 6H•EK•Cp-tioninaII. 2: Digestão do clone 2 do pDonr207•K•6H•EK•Cp-tioninaII com as enzimas de restrição SalI/SacI, apresentado um fragmento de 220 pares de bases equivalente ao 6H•EK•Cp- tioninaII.

Tendo sido a sequência de nucleotídeos correspondente ao gene de interesse confirmado por sequenciamento (Macrogen-Coreia), foi feita a recombinação utilizando a técnica Gateway®. Foram utilizados como vetor de destino o vetor pK2GW e o vetor PVX-GW. Entretanto, não foi possível obter clones apropriados, provavelmente devido a problemas com a enzima Clonase II®. Como alternativa para a obtenção de um vetor para transformação de plantas, foi utilizada o fragmento Cp-tioninaII foi retirado do vetor para clonagem em outro vetor.

6.1.2 Vetor de transformação pCambia·K·EK·6H·Cp-tioninaII

O fragmento 6H·EK·Cp-tioninaII obtido a partir da digestão do vetor pDonr207·6H·EK·Cp-tioninaII com as enzimas SalI/SacI (figura 13, banda B) foi clonado no vetor pCambia1300·K. Após a transformação e obtenção do DNA- plasmidial foi realizada uma digestão com as enzimas de restrição HindIII e SacI para confirmação da clonagem, com o aparecimento de um fragmento do tamanho esperado de 800 pares de bases, que equivalem ao Promotor 35s·K·EK·6H·CptioninaII (figura 14).

Figura 13: Digestão pDonr207•K•6H•EK•Cp-tioninaII SalI/SacI. Gel de agarose com brometo de etídeo evidenciando os fragmentos DNA sob luz UV, DNA pDonr207•K•6H•EK•Cp-tioninaI após digestão em gel de Agarose, sob luz UV. M: marcador de peso molecular 1Kb ladder Promega®; Linha 1: Digestão do pDonr207•K•6H•EK•Cp-tioninaII com as enzimas de restrição SalI/SacI, apresentado um fragmento de 220 pares de bases equivalente ao 6H•EK•Cp-tioninaII. Em A: está representado o fragmento pDonr207•K e B: o fragmento 6H•EK•Cp-tioninaII

Este cassete de expressão possui o peptídeo sinal, o Kappa (K) que direciona o peptídeo ao RE onde ocorrem modificações pós-traducionais, seguido pelo direcionamento para o apoplasto. Este local oferece uma vantagem relacionada ao papel essencial deste local na regulação das interações patogênicas (ANAND et al., 2004). Estudos sugerem que proteínas localizadas no apoplasto estão posicionadas em direção ao local de contato do patógeno durante o processo de infecção, reforçando a hipótese de que estas proteínas atuem na defesa do hospedeiro (WITZEL et al., 2011). Esse direcionamento vai de encontro do intuito deste trabalho que é expressar a Cp-tionina II visando à proteção do hospedeiro contra patógenos.

Figura 14: Digestão pCambia·K·EK·6H·CptioninaII com HindIII/EcoRI . Gel de agarose com brometo de etídeo evidenciando os fragmentos DNA sob luz UV, digestão do vetor pCambia·K·EK·6H·CptioninaII com as enzimas HindIII e SacI. 1: Clone 1 e 2: Clone 2, resultando em um fragmento de 800 pares de base o que equivale ao 35s·K·EK·6H·CptioninaII.

6.1.3 Vetores de transformação pCambia2300·K·CptioninaII e pCambia2300·K·CptioninaII·Kdel

M 1

A

B

Para obter estas construções na qual o gene Cp-tionina II fosse expresso sem resíduos adicionais (i.e. cauda de histidina, etc.) utilizamos o vetor pCambia1300·K digerido com as enzimas de restrição SalI e SpeI (figura 15 linha 1) e SaIl e XbaI (figura 15 linha 2). O fragmento/inserto Cp-tioninaII Sall/SpeI (figura15 linha 3) foi obtido após a digestão do vetor de síntese pBS-K·Cp-tioninaII. Os fragmentos respectivos aos vetores juntamente com o fragmento da Cp-tionina II SalI/SpeI foram purificados e posteriormente realizado a reação de ligação.

Figura 15: Digestões vetores de transformação pCambia1300·k SalI/XbaI e Sai/SpeI e pBS-K·Cp- tioninaII SalI/XbaI . Gel de agarose com brometo de etídeo evidenciando os fragmentos DNA sob luz UV. M: Marcador de peso molecular Kb-ladder Plus Invitrogen® ; 1: Digestão do DNA plasmidial pCambia1300·k· com as enzimas de restrição SalI e SpeI liberando um fragmento (que não era de nosso interesse); 2: Digestão do DNA plasmidial pCambia1300·k· com as enzimas de restrição SalI e

XbaI liberando um fragmento (que não era de nosso interesse) 3: Digestão do DNA plasmidial pBS-

K·Cp-tioninaII com as enzimas de restrição SalI e SpeI, liberando fragmento da Cp-tioninaII tamanho aproximado de 160 pares de bases.

O vetor pCambia 1300 contém o gene de seleção hpt, que confere resistência a higromicina e o cassete contendo o gene Cp-tioninaII estão clonado entre os sítios HindIII e EcoRI. Este cassete foi removido e clonado em outro vetor o pCambia2300, também nos sítios HindIII e EcoRI.

Esta substituição foi feita porque o vetor pCambia2300 apresenta o gene de seleção nptII, que confere resistência a canamicina. Este agente de seleção é mais conveniente do que a higromicina, do posto de vista de biossegurança, por apresentar menor toxidez, facilitando sua manipulação, e também pelo menor custo (NAP et al., 1992).

Para isso foi realizada a digestão dupla com as enzimas HindIII e EcoRI no vetor o pCambia 2300 (figura 16- linha 3), para criar as extremidade necessárias para a inserção do nosso inserto de interesse. As construções apresentavam sítios destas mesmas enzimas (HindIII e EcoRI) nas extremidade do cassete, assim foi feita a digestão para liberação do cassete completo que correspondem às moléculas

CaM35S·Kappa·Cp-tioninaII·Tnos ou CaM3S·Kappa·Cp-tioninaII·Kdel·Tnos (figura 16 linhas 1 e 2 respectivamente).

Figura 16: Digestão pCambia1300·K·CptioninaII·Kdel e pCambia1300·K·CptioninaII com HindIII/EcoRI. Gel de agarose com brometo de etídeo evidenciando os fragmentos DNA sob luz UV. M: Marcador de peso molecular Kb-ladder Plus Invitrogen® ; 1: Digestão do vetor pCambia1300·K·CptioninaII com as enzimas HindIII e EcoRI, liberando o fragmento equivalente ao

Cassete completo CAM35s·Kappa·Cp-tioninaII·T35s tamanho de aproximadamente 1200 pares de

bases; 2: Digestão do vetor pCambia1300·K·CptioninaII·Kdel com as enzimas HindIII e EcoRI, liberando o fragmento equivalente ao Cassete completo CAM35s·Kappa·Cp-tioninaII·Kde·T35s tamanho de aproximadamente 1200 pares de bases ; 3: Digestão do vetor pCambia 2300 com as enzimas de restrição HindIII e EcoRI (vetor linearizado).

A confirmação da clonagem do cassete no vetor pCambia2300 foi feita pela digestão com HindIII e EcoRI e liberação de fragmento de 1200 pares de bases correspondente ao cassete completo (figura 17) e por sequenciamento. Em seguida células de Agrobacterium tumefaciens (linhagem EHA105) foram transformados por eletroporação com este vetor.

Figura 17: Digestão de confirmação pCambia2300·K·CptioninaII·Kdel e pCambia2300·K·CptioninaII com as enzimas HindIII/EcoRI. Gel de agarose com brometo de etídeo evidenciando os fragmentos DNA sob luz UV, confirmação da ligação do vetor pCambia 2300 com o fragmento Cassete CAM35s·Kappa·Cp-tioninaII·Terminador35s. M:Marcador de peso molecular Kb-ladder Plus Invitrogen® ; 1: Digestão parcial do vetor pCambia2300·K·CptioninaII com a enzima HindIII, (linearizado); 2: Digestão final do vetor com HindIII e EcoRI, liberando o fragmento equivalente ao

Cassete CAM35s·Kappa·Cp-tioninaII·T35s; 3: Digestão parcial do vetor

pCambia2300·K·CptioninaII·Kdel com a enzima HindIII, (linearizado); 4: Digestão final do vetor com a enzima HindIII e EcoRI, liberando o fragmento equivalente ao Cassete CAM35s·Kappa·Cp- tioninaII·Kdel ·T35s tamanho de aproximadamente 1200 pares (digestão parcial vetor).

M 1 2 3