Rettskilders argumentasjonsverdi

É um equipamento automatizado de diagnóstico aplicado à determinação de parâmetros hematológicos, por ensaio colorimétrico e citometria de fluxo, associada a diversas reações citoquímicas, sobretudo a partir de amostras de sangue total. O equipamento é composto por uma parte mecânica, em que o Circuito Unificado de Fluídos (UFC) é o principal componente e uma parte ótica (Conjunto Ótico Peroxidase e Conjunto Ótico Laser), e fornece os seguintes resultados (Manual ADVIA® 2120/2120i Hematology Systems, 2010):

51  CBC mais contagens diferenciais dos leucócitos (CBC/diff)

 Contagens absolutas de percentagem e índices de reticulócitos (retic)  CBC/diff mais retic (CBC/diff/retic)

 CBC/retic

A amostra passa pelo um filtro anti-coágulo sendo, posteriormente, recolhida por uma válvula de segmentação, que divide a amostra em 5 alíquotas para os diferentes testes. As alíquotas são enviadas para as câmaras/canais de reação, no conjunto do UFC, onde a amostra e os reagentes são misturados, ocorrendo uma reação citoquímica. Existem as seguintes câmaras de reação (Manual ADVIA® 2120/2120i Hematology Systems, 2010):

 Câmara de Reação da Hemoglobina (HGB)  Câmara de Reação de Basófilos (BASO)

 Câmara de Reação de Eritrócitos e Plaquetas (RBC/Plt)  Câmara de Reação de Reticulócitos (Retic.)

 Câmara de Reação da Peroxidase (PEROX)

No final da reação as misturas (amostra e reagente) são enviadas para análise, nas células de fluxo, exceto para a hemoglobina (a câmara de reação serve de cuvete ótica, onde é efetuado a leitura da hemoglobina). Depois da análise, a mistura é eliminada e as vias e câmaras de reação usadas, são lavadas. Seguidamente, os resultados dos testes são enviados para o computador a fim de serem editados e revistos (Manual ADVIA®

2120/2120i Hematology Systems, 2010).

O sistema ótico é constituído por 3 conjuntos óticos: o conjunto do colorímetro para hemoglobina; conjunto ótico da peroxidase; conjunto ótico para os métodos de análise de basófilos, eritrócitos/plaquetas e reticulócitos (Manual ADVIA® 2120/2120i Hematology Systems, 2010; Simão D., 2013).

Canal da Hemoglobina:

A determinação da hemoglobina realiza-se por método colorimétrico de determinação sem cianeto. O processo inicia-se com a lise dos eritrócitos e libertação da hemoglobina, através da adição do reagente à amostra (câmara de reação). Seguidamente, o ferro do heme é oxidado, passando do estado ferroso (Fe2+) para o férrico (Fe3+), o que leva à coordenação de um ião de hidróxido e de uma molécula de água com um ligando

52 axial e a subsequente formação de monoaquomonohidroxiferri-porfirina, cuja transmitância é lida na câmara de reação a 546 nm. O cálculo da hemoglobina resulta da comparação entre as leituras de referência e a amostra, onde a luz transmitida de cada amostra é convertida em concentração (Manual ADVIA® 2120/2120i Hematology Systems, 2010).

Canal de Basófilos:

A reação ocorre em duas etapas. Na primeira ocorre a lise dos eritrócitos e das plaquetas. Na segunda, todos os leucócitos (exceto os basófilos) são separados do seu citoplasma pela a ação do reagente e do aumento da temperatura na câmara. Depois da reação, a suspensão celular passa por uma célula de fluxo, a um volume constante, onde as sequências características da luz dispersa (ângulo baixo e alto), de cada célula, são medidas, segundo o tamanho da célula ou do núcleo e a configuração do núcleo (combinação da forma do núcleo com a densidade celular). Desta forma, os leucócitos são separados e classificados em células mononucleares ou polimorfonucleares (Manual

ADVIA® 2120/2120i Hematology Systems, 2010).

O citograma BASO (figura 1) os clusters (populações) resultam da combinação da configuração do núcleo (ângulo alto), no eixo x, e do tamanho das células (ângulo baixo), no eixo y. Através da análise dos clusters é possível identificar cada população (segundo a sua posição, área e densidade) e contar o número de células/núcleos presentes em cada população (Manual ADVIA® 2120/2120i Hematology Systems, 2010).

Figura 1: Citograma BASO obtido a partir de uma amostra de um doente (adaptado do Manual ADVIA®

2120/2120i Hematology Systems, 2010). Legenda: 1) Ruído; 2) Núcleos de células blásticas; 3) Leucócitos

mononucleares (núcleos de monócitos e linfócitos); 4) Basófilos; 5) Baso Suspect; 6) Saturação; 7) Leucócitos polimorfonucleares (núcleos de neutrófilos e de eosinófilos).

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Canal de Eritrócitos e Plaquetas:

As reações citoquímicas de eritrócitos/plaquetas ocorrem em duas etapas. Primeiro, o uso de um reagente com dodecil sulfato de sódio (SDS) e glutaraldeído faz com que os eritrócitos e as plaquetas sejam isovolumetricamente esferificados, ou seja, elimina a forma celular (fator de variabilidade). Depois, ocorre a fixação dos eritrócitos e das plaquetas (Manual ADVIA® 2120/2120i Hematology Systems, 2010).

• Eritrócitos

Na análise dos eritrócitos é usado um par de sinais de dispersão de luz (ângulo baixo e alto). Segundo a teoria de Mie, através da medição e respetiva conversão da dispersão da luz, para as esferas homogéneas, obtêm-se o volume celular (ângulo baixo) e a concentração de hemoglobina (ângulo alto). Os histogramas e citogramas mais relevantes são os seguintes (Manual ADVIA® 2120/2120i Hematology Systems, 2010):

✓ Histograma de volume dos eritrócitos (figura 2): mostra a distribuição de eritrócitos por volume celular. Apresenta um intervalo entre 0 fl e 120 fl. A partir deste histograma são calculados o RDW e o VGM.

Figura 2: Histograma de volume de eritrócitos (amostra normal) (adaptado do Manual ADVIA® _2120/2120i

Hematology Systems, 2010). Legenda: 1) Região microcítica; 2) Região normocítica; 3) Região

macrocítica; 4) Marcador de 60 fl; 5) Marcador de 120 fl.

✓ Histograma de concentração de hemoglobina de eritrócitos (figura 3): representa, independentemente do volume celular, a distribuição de eritrócitos por concentração de hemoglobina num intervalo entre 0 g/dl e 50 g/dl. A partir do histograma é calculado o CHCM.

54 Figura 3: Histograma de concentração de hemoglobina de eritrócitos (amostra normal) (adaptado do Manual ADVIA® _{2120/2120i Hematology Systems, 2010). Legenda: 1) Região hipocrómica; 2) Região}

normocrómica; 3) Região hipercrómica; 4) Marcador de 28 g/dl; 5) Marcador de 41 g/dl.

✓ Citograma de volume e concentração de hemoglobina dos eritrócitos (figura 4): representa a concentração de hemoglobina (eixo x) e o volume celular (eixo y), visualizando-se apenas os eritrócitos.

Figura 4: Citograma de volume e concentração de hemoglobina dos eritrócitos (adaptado do Manual

ADVIA® _{2120/2120i Hematology Systems, 2010). Legenda: 1) Marcador de volume dos eritrócitos de 60}

fl; 2) Marcador de volume de 120 fl; 3) Marcador de concentração da hemoglobina 28 g/dl; 4) Marcador de concentração de 41 g/dl. Os marcadores organizam o citograma em 9 áreas distintas de morfologia celular.

• Plaquetas

Na análise de plaquetas, segundo a teoria de Mie, os sinais de dispersão de luz de ângulos baixo e alto para cada célula são convertidos em valores de concentração e de volume de refração (Manual ADVIA® 2120/2120i Hematology Systems, 2010).

✓ Citograma de dispersão de plaquetas (figura 5): representa o coeficiente de refração (n), entre 1,3500 e 1,4000 (eixo x), e o volume celular, entre 0 fl e 30 fl (eixo y), que corresponde às plaquetas. As células com volumes > 30 fl são identificadas através do citograma de dispersão dos eritrócitos.

55 Figura 5: Citograma de dispersão de plaquetas (adaptado do Manual ADVIA® _{2120/2120i Hematology}

Systems, 2010). Legenda: 1) Plaquetas; 2) Plaquetas gigantes; 3) Eritrócitos; 4) Fragmentos de eritrócitos;

5) Fantomas de eritrócitos. Os fragmentos e fantomas de eritrócitos não são incluídos na contagem de plaquetas, sendo enumerados para fins de alarme.

Canal de Reticulócitos:

Na análise dos reticulócitos, depois de estes serem isovolumetricamente esferificados, são corados conforme o seu conteúdo em ARN (ácido ribonucleico), graças ao agente catiónico (oxazina 750). Depois da coloração, um volume constante da suspensão passa pela respetiva célula de fluxo (na câmara de reação), onde as sequências características da dispersão da luz (ângulo baixo e alto) e de absorção são medidas para cada célula. Desta forma, o tamanho da célula e a concentração de hemoglobina são proporcionais às sequências características da dispersão da luz, enquanto a absorção da luz é proporcional à ao conteúdo (os eritrócitos maduros absorvem menos do que os reticulócitos corados). Após processamento da informação, obtém-se o seguinte citograma (figura 6) (Manual ADVIA® _{2120/2120i Hematology Systems, 2010):}

✓ Citograma de absorção e dispersão de reticulócitos: apresenta as medições de absorção e de dispersão de luz que correspondem à maturação celular (absorção da luz), no eixo x, e ao tamanho das células (dispersão da luz), no eixo y.

56 Figura 6: Citograma de absorção e dispersão de reticulócitos (adaptado do Manual ADVIA® _2120/2120i

Hematology Systems, 2010). Legenda: 1) Valor limite de plaquetas dos reticulócitos; 2) Valor limite de

coincidência dos reticulócitos; 3) Valor limite dos reticulócitos; 4) Valor limite dos reticulócitos baixos/médios; 5) Valor limite dos reticulócitos médios/altos; A) Eritrócitos maduros; B) Reticulócitos de absorção baixa; C) Reticulócitos de absorção média; D) Reticulócitos de absorção elevada; E) Plaquetas; F) Ocorrências de coincidências.

Canal da Peroxidase:

As reações citoquímicas da peroxidase, na câmara de reação, compreendem três etapas principais. Na primeira etapa, ocorre a lise dos eritrócitos através da adição do reagente (contém tensioativos (dodecil sulfato de sódio e Brij-35)) e do choque térmico (temperatura entre 58,0 e 72,1°C). Na etapa seguinte, os leucócitos são fixados pela ação do formaldeído. Durante a reação, a amostra encontra-se num meio hipertónico, o que provoca um ligeiro encolhimento e crenação celular (contribui para o ruído). A fixação dos leucócitos aumenta o índice de refração e de deteção das células, para além do ruído (constituído por plaquetas, tecido de eritrócitos e detritos, sendo excluídos da contagem total e diferencial de leucócitos). Na última etapa, ocorre a coloração dos leucócitos, onde o 4-Cloro-1-naftol serve de substrato ao peróxido de hidrogénio, originando um precipitado escuro nas zonas de atividade da peroxidase endógena (granulações dos leucócitos), segundo a seguinte equação (Manual ADVIA® 2120/2120i Hematology Systems, 2010):

H2O2 + 4-Cloro-1-naftol →(Peroxidase celular)→ Precipitado escudo (interior das células)

Os leucócitos são identificados de acordo com o seu tamanho e nível de intensidade de coloração (peroxidase). Desta forma, os linfócitos, basófilos e células grandes, permanecem sem coloração (não possuem peroxidase), ao contrário dos neutrófilos, eosinófilos e monócitos, que exibem uma coloração de acordo com os seus

57 níveis de atividade da peroxidase (Manual ADVIA® 2120/2120i Hematology Systems,

2010).

Após a reação, a suspensão de células, a um volume constante, passa pela respetiva célula de fluxo (uma célula de cada vez), onde a quantidade de luz dispersa (tamanho) e a absorção (coloração pela peroxidase), são medidas. Depois do processamento automático, obtém-se o seguinte citograma (Manual ADVIA® 2120/2120i Hematology Systems, 2010):

✓ Citograma PEROX (figura 7): representa a absorção (eixo x) e a dispersão (eixo y) da luz, que quando combinadas, obtém-se clusters distintos. Cada população celular é identificada, com base na posição, densidade e área, e determinada o número de células em cada população através da análise dos clusters.

Figura 7: Citogramas PEROX (adaptado do Manual ADVIA® _{2120/2120i Hematology Systems, 2010).}

Legenda: 1) Ruído; 2) Eritroblastos; 3) Agregados plaquetários; 4) Linfócitos e basófilos; 5) Células grandes não coradas; 6) Monócitos; 7) Neutrófilos; 8) Eosinófilos.