Hva menes med «force»?

Com o objectivo de analisar a hipótese de uma origem precoce de alguns antioxidantes, durante a evolução num período anterior ao grande acontecimento oxidativo que ocorreu há 2300 Ma, com o aumento de O2 na atmosfera e oceanos para

valores próximos de 1% da actualidade, estimaram-se os respectivos tempos de origem a partir das relações filogenéticas das sequências proteicas. A origem temporal na evolução, para cada um dos enzimas analisados encontra-se apresentada na figura 22.

Figure 22 Estimativa dos tempos de origem dos enzimas: Glutationo peroxidase (GPX); Catalase; Peroxiredoxina típica com 2 cisteínas (PRX); A/G adenina glicosilase (A/G-GLY); Fe/Mn Superóxido dismutase (FeSOD); CuZn Superóxido dismutase (CuZnSOD) e Glutationo sintetase (GSHS). Os tempos foram calculados a partir das distâncias genéticas das respectivas árvores filogenéticas usando o esqualeno monooxigenase, esqualeno-hopenociclase e RNA polimerase III como marcadores evolutivos. As árvores foram inferidas com o algoritmo Neighbor-Joining (NJ) (Atteson 1997) e a distribuição dos tempos estimados para cada enzima encontram-se em caixas de bigodes, cujos extremos superior e inferior correspondem a um percentil de 95%, o 2º quartil e 3º quartil correspondem aos limites das caixas, a linha interior da caixa indica a mediana e o + indica a média. Os valores numéricos da média, desvio padrão e número total de sequências de aminoácidos usadas (n) encontram-se à direita. Executaram-se testes estatísticos de Mann-Whitney que mostraram diferenças significativas (p<0.05) entre os tempos estimados para cada par de enzimas vizinhos.

70 As estimativas do tempo de origem dos antioxidantes, Glutationo (GSH), Catalase, Superóxido dismutases CuZn e Fe/M, são anteriores ao início da acumulação de O2 na atmosfera há 2300 Ma. Foram executados testes de Mann-Whitney que

mostraram diferenças significativas (p <0,05) entre os tempos estimados para cada par de enzimas vizinhos testados dois a dois. Segundo estas estimativas, o Glutationo sintetase (GSHS) tem uma origem na evolução há (3,6 ± 0,2) 103 Ma. Este resultado sugere que o GSH era sintetizado nas células ancestrais num período na evolução próximo da origem da vida. Dentro dos enzimas analisados, o segundo enzima mais antigo é o Catalase com uma origem há (3,5 ± 0,2) 103 Ma. O valor estimado da origem do Catalase está de acordo com o proposto por Da Silva (2006), que sugere uma origem há pelo menos 3200 Ma, baseado apenas na existência do Catalase em bactérias como a Cianobactéria. As estimativas da origem das duas classes de superóxido dismutase, sugerem que o SOD com o Cu e Zn no seu centro catalítico surgiram primeiro na evolução há cerca de (3,1 ± 0,4) 103 Ma e o SOD com o Fe no seu centro catalítico depois há cerca de (2,9 ± 0,4) 103 (p < 0,05). O A/G adenina glicosilase (A/G-GLY) é um enzima de reparação do DNA por danos oxidativos, sendo um indicador da presença de stress oxidativo que afecta o DNA e que também foi analisado filogeneticamente. A estimativa da sua origem na evolução é de (2,7 ± 0,2) 103 Ma atrás e sugere que houve stress oxidativo e danos oxidativos no DNA, nas células ancestrais durante este período. As estimativas dos tempos de origem da Peroxiredoxina e do Glutationo peroxidase, colocam estes enzimas perto do inicio da acumulação de O2 na atmosfera, com uma

origem estimada de (2,6 ± 0,3) 103 Ma e (2,4 ± 0,4) 103 Ma respectivamente. Estes resultados sugerem que a evolução destes enzimas possa ter ocorrido em resposta ao aumento do O2 com o inicio do aparecimento da fotossíntese há 2500 Ma.

71

4.

4.

4.

4. DISCUSSÃODISCUSSÃODISCUSSÃODISCUSSÃO

Segundo vários autores, o O2 começou a acumular-se na atmosfera aquando da

origem da fotossíntese oxigénica há 2500 Ma, atingindo cerca de 1% do nível actual há 2300 Ma (Holland 2006, Summons, et al. 2006, Madigan, Martinko e Parker 1997, Galea e Brown 2009, Williams e Da Silva 2006). Para estes autores, este período na evolução é denominado como o grande acontecimento oxidativo e é considerado como a pressão selectiva que motivou a evolução dos sistemas antioxidantes.

No presente estudo, analisou-se a hipótese da origem precoce dos sistemas antioxidantes na evolução, num período anterior à acumulação do oxigénio na atmosfera há 2300 Ma. Esta hipótese, baseia-se na formação de ROS exógenas no ambiente químico dos oceanos ancestrais pela radiação ionizante em conjunto com os elevados níveis de Fe(II), propostos para estes ambientes (Cockell 2000, Williams e Da Silva 2006). O modelo cinético desenvolvido, neste trabalho de investigação, permitiu-nos simular o ambiente químico dos oceanos e prever quais as concentrações de ROS exógenas bem como inferir a capacidade de dano de moléculas biológicas pela sua exposição a estas espécies, desde a superfície dos oceanos até às zonas afóticas e ao longo da evolução. Os vários testes ao modelo cinético desenvolvido (secção 3.1 dos resultados) permitiu uma validação experimental do modelo, de modo a inferir previsões acerca da concentração de H2O2 e ROS no ambiente oceânico em função da

[O2], [CO2], [Fe(II)], [Fe(III)], [SH-], intensidade de radiação UV e gama existente nos

oceanos.

Segundo as previsões do modelo apresentadas nas secções 3.2, 3.5 e 3.6, os radicais H● e o CO3●- são os que apresentam maior potencial de reacção com as

proteínas no ambiente dos oceanos, quando comparados com os radicais analisados. O modelo prevê níveis de exposição a estes radicais 103 vezes superiores na zona fótica (0-130 m) dos oceanos arqueozóicos (3800-2500 Ma), quando comparados com a actualidade. Os cálculos das respectivas constantes de pseudo-primeira ordem, colocam os oceanos arqueozóicos como ambientes 103 vezes mais reactivos com proteínas do que na actualidade (figuras 21c e 21d da secção 3.6). Estes resultados sugerem que os organismos ancestrais estavam sujeitos a uma pressão selectiva para a evolução de sistemas antioxidantes de modo a proteger o seu proteoma. É geralmente aceite na comunidade científica, que organismos fototróficos análogos às cianobactérias evoluíram nestes habitats há 3800-3500 Ma, pela necessidade da captação da energia

72 solar, colocando-os em contacto permanente com esta fonte de radicais (Fischer 2008, Williams e Da Silva 2006, Madigan, Martinko e Parker 1997). Contudo, será que a reactividade com proteínas prevista para os oceanos arqueozóicos induz um estado de stress oxidativo nas células expostas a este ambiente? Uma evidência que apoia a tendência para o fenómeno de stress oxidativo no ambiente arqueozóico é a observação da inactivação do fotossistema e inibição da proliferação em organismos fotossintéticos, nas zonas junto à superfície dos oceanos actuais (0-35 m), durante a exposição à radiação UV (Piazena, et al. 2002). Como os radicais H● e CO3●- e a reactividade com

proteínas na zona fótica (0-130 m) dos oceanos arqueozóicos é superior à reactividade prevista para a superfície dos oceanos na actualidade, então os organismos ancestrais provavelmente estariam sob stress oxidativo se não possuíssem defesas antioxidantes. No entanto, não há evidências que os radicais H● e CO3●- sejam os principais causadores

do stress oxidativo, mas é aceite que os radicais H● e CO3●- exógenos, ao difundirem-se

para a zona do periplasma ou citoplasma, provocam danos nas proteínas destes compartimentos celulares. Estes radicais podem reagir com os aminoácidos das proteínas expostas ao solvente, que se encontram em fase aquosa ou incorporadas nas membranas biológicas, com a formação de radicais centrados no carbono dos aminoácidos (Finkel e Holbrook 2000, Kehrer 2000). Os radicais centrados no carbono dos aminoácidos, tendem a reagir entre si de modo a formar ligações cruzadas entre proteínas, levando à formação de agregados proteicos e à sua acumulação na célula (Kehrer 2000, Sonntag 1987). Tendo em consideração as razões apresentadas por Sonntag (1987) e Kehrer (2000), os possíveis danos associados à acumulação destes agregados, durante a exposição contínua aos radicais H● e CO3●-, podem causar a

inactivação da função das proteínas envolvidas nos vários processos metabólicos decorrentes nesse compartimento como, por exemplo, a inactivação do sistema fotossintético. Por outro lado, a acumulação destes agregados pode ter consequências tóxicas para a célula, levando à morte celular (Finkel e Holbrook 2000). No caso das células ancestrais residentes nos oceanos arqueozóicos (3800-2500 Ma), se estas não possuíssem qualquer sistema de reparação ou antioxidante que as protegesse dos radicais H● e CO3●-, provavelmente acumulariam danos que as tornariam inviáveis

nestes ambientes. De modo a ilustrar o impacto destes radicais nas proteínas destas células, a velocidade de degradação das proteínas por via oxidativa pode ser calculada simplesmente pelo produto entre a constante de pseudo-primeira ordem da reactividade do ambiente e a concentração de proteína total. Assumindo que a concentração total de

73 proteínas é próxima do valor médio estimado para as bactérias actuais de 0,35 M

(http://bionumbers.hms.harvard.edu), e considerando as constantes de pseudo-primeira

ordem da reactividade do H● e do CO3●- com as proteínas na zona fótica do oceano há

3500 Ma (1,6x10-8 s-1 a 2,0 x10-5 s-1), calculadas neste estudo (figura 21d da secção 3.6), teríamos uma velocidade de degradação via oxidação que varia entre os 7 μM.s-1 para a superfície do oceano e 0,006 μM.s-1 para os 130 m. A velocidade média estimada de turnover proteico para a bactéria E. Coli é cerca de 2%.h-1

(http://bionumbers.hms.harvard.edu), que corresponde a uma velocidade de degradação

cerca de 2 μM.s-1. A Comparação destas velocidades de degradação sugere que no ambiente dos oceanos arqueozóicos, a via oxidativa é cerca de 3,5 vezes superior na superfície e constituiria uma ameaça ao proteoma dos organismos ancestrais. Tendo em conta estes argumentos, poderá dizer-se que os radicais H● e do CO3●- exógenos seriam

uma condicionante ambiental à longevidade dos organismos ancestrais, que vai ao encontro da teoria do envelhecimento celular por radicais (Finkel e Holbrook 2000). Com base nas razões acima apresentadas, a exposição continuada aos radicais H● e CO3●- prevista para a zona fótica dos oceanos arqueozóicos (com uma concentração 103

vezes superior à actualidade), aparenta ser uma fonte de stress oxidativo que constitui uma pressão selectiva para a evolução de sistemas antioxidantes. Assim sendo, os organismos primitivos que desenvolvessem sistemas de protecção ou reparação do seu proteoma seriam seleccionados por um processo de selecção natural, que os permitiram passar os seus genes à geração seguinte, enquanto os organismos primitivos sem sistemas antioxidantes ou de reparação seriam extintos.

Por outro lado, os resultados obtidos na análise das relações filogenéticas entre os vários antioxidantes analisados, revelou que, os antioxidantes GHS, Catalase e SOD têm uma origem evolutiva precoce (figura 22 da secção 3.7), num período anterior ao grande acontecimento oxidativo. A estimativa que indica a evolução da síntese do GSH há cerca de (3,6 ± 0,2) 103 Ma, próximo da origem da vida, está de acordo com as previsões do modelo, que sugerem um elevado potencial oxidativo para o proteoma na zona fótica dos oceanos arqueozóicos, durante este período. Comparando os níveis exógenos das RS e a respectiva reactividade com biomoléculas, previstas para os oceanos no período arqueozóico, os elevados níveis de H● e CO3●- aparentam ter sido a

pressão selectiva que motivou a evolução da síntese do GSH de modo a proteger o proteoma das células ancestrais. Outro resultado que apoia a evolução da síntese do

74 GSH em resposta à pressão selectiva dos radicais exógenos H● e CO3●- é a separação de

1000 Ma entre a origem do GSH e do GPX, sugerindo que o GSH possa ter um papel importante como antioxidante do proteoma. De facto, poderá dizer-se que o GSH em elevadas concentrações pode proteger as proteínas reagindo ele próprio com o CO3●-,

originando o radical GS● e HCO3-, sendo que a constante cinética deste processo é de

5,3 x106 M-1s-1 (Chen e Hoffman 1973). Os radicais GS● formados tendem a reagir entre si formando a forma oxidada do glutationo (GSSG). No entanto, a reacção do GSH por si só seria um grande desperdício de recursos celulares, pouco eficiente, e todo o GSH rapidamente se esgotaria na célula, acumulando-se na forma de GSSG. Por outro lado, o GSH não reage com o radical H● e assim as proteínas não seriam protegidas deste radical. Contudo, Shafferman (1972) identificou a reacção do H● com o GSSG, que regenera uma molécula de GSH e forma um radical GS●, de uma forma quase instantânea (k = 1,0 x1010 M-1s-1). Tendo em conta as reacções que envolvem os radicais H● e CO3●- e as formas GSH/GSSG acima descritas, e que a reacção entre os radicais

H● e CO3●- não foi identificada, propomos que a síntese do GSH possa ter protegido o

proteoma dos organismos fotossintéticos expostos aos elevados níveis de H● e CO3●-

pelo seguinte mecanismo reaccional:

A partir deste mecanismo, o GSH por si só, actua como um catalisador da redução do CO3●- com o auxílio do H● como agente redutor da sua forma oxidada. Outra

hipótese alternativa, que ainda carece de análise, é a origem precoce na evolução do enzima Glutationo redutase, que reciclaria o GSH a partir do GSSG com consumo de NADH. Por estes motivos, propomos também que a origem da síntese do GSH na evolução há cerca de 3600 Ma tenha sido uma resposta adaptativa das células ancestrais

75 fotossintéticas ao stress oxidativo em proteínas, causado pelos elevados níveis de H● e CO3●- formados na zona fótica do oceano ancestral.

Em relação à reactividade com moléculas de DNA, as previsões do modelo sugerem que o potencial oxidante dos radicais exógenos presentes no oceano não se alterou ao longo da evolução, mantendo-se aproximadamente constante até aos dias de hoje (figura 21f). O modelo prevê também que as espécies formadas no ambiente oceânico, com maior potencial oxidante para moléculas de DNA são os radicais HOO● e O2●-. De

facto, não se sabe se estes radicais de origem exógena constituem uma ameaça efectiva para o DNA. Contudo, se estes conseguirem difundir-se até ao citoplasma, atravessando a membrana plasmática, a reacção com os nucleótidos da molécula de DNA causaria mutações genéticas que podem levar à inviabilidade celular (Finkel e Holbrook 2000, Kehrer 2000). Neste cenário, em organismos ancestrais que fossem completamente desprovidos de sistemas de protecção ou reparação do DNA, a continua exposição a estes radicais exógenos sobretudo nas zonas fóticas junto à superfície acarretaria uma taxa de mutação genética elevada e contínua, que levaria a uma eventual acumulação de mutações, comprometendo a viabilidade celular. Por outro lado, esta fonte de radicais exógenos poderá ter sido o motor da evolução dos organismos, que levou à biodiversidade observada na actualidade. Como o GSH reage com o HOO●/O2●- (Asada

e Kanematsu 1976, Sekaki, Gardes-Albert e Ferradini 1984), a sua existência em elevadas concentrações no compartimento periplasmático ou citoplasmático das células ancestrais poderia constituir uma barreira eficaz na protecção do DNA. A origem estimada do enzima de reparação do DNA A/G Adenina glicosilase há (2,7 ± 0,2) 103 Ma, através da análise filogenética feita neste trabalho, suporta a noção de que o DNA estaria eficazmente protegido do stress oxidativo pelos radicais exógenos entre os 3800 Ma e os 3000 Ma atrás. No entanto, o aparecimento deste enzima num período durante a evolução em que o modelo não prevê aumentos de ROS exógenas, sugere que o desenvolvimento deste enzima tenha sido em resposta a um aumento de ROS endógenos. Por outro lado, o modelo prevê que os níveis de HOO● 102 vezes superiores à actualidade,presentes na zona fótica dos oceanos ancestrais, diminuíram ao longo da evolução e a sua forma iónica, o O2●-, manteve-se em concentrações aproximadamente

na mesma ordem de grandeza (figura 21c). Contudo, se estes níveis de O2●- exógenos

fossem capazes de causar danos ao DNA, seria de esperar que a origem dos SOD’s fosse anterior ao estimado, tal como se estimou para o GSH. Os resultados da estimativa da origem dos SOD’s, (3,1 ± 0,4) 103 Ma e (2,9 ± 0,4) 103 Ma para o CuZnSOD e

76 FeSOD respectivamente, sugerem que neste período surgiu uma outra fonte de stress oxidativo que justificasse a evolução destes antioxidantes. É de salientar que estas estimativas vão de encontro ao período proposto para a origem na evolução do metabolismo aeróbio há 3000-2500 Ma (Madigan, Martinko e Parker 1997, Williams e Da Silva 2006, Battistuzzi, Feijao e Hedges 2004), sugerindo que a pressão selectiva para evolução dos SOD’s tenha sido maioritariamente devido à formação de O2●-

endógeno, proveniente do metabolismo aeróbio emergente.

A toxicidade do H2O2 é geralmente associada há sua elevada capacidade de se

difundir pelas membranas biológicas e reagir com inúmeros compostos intracelulares, originando o radical HO●, com consequente stress oxidativo (Kehrer 2000). Os perfis evolutivos de exposição ao H2O2 previstos para os oceanos (figura 21a), indicam que

houve um aumento na concentração média de H2O2 na zona fótica do oceano, que se

iniciou logo após a origem da vida, atingindo um valor máximo há 3500 Ma, que corresponde a cerca de 70% do nível médio actual. Este nível diminui para cerca de 20% do nível médio actual, passados 500 Ma, e só aumenta após o início da acumulação de O2 na atmosfera há 2500 Ma. A estimativa da origem do Catalase há (3,5 ± 0,2) 103

Ma por análise filogenética coincide com este aumento de H2O2 previsto pelo modelo,

sugerindo que a evolução do Catalase foi motivada pela pressão selectiva exercida pelo H2O2 exógeno, formado na zona fótica do oceano arqueozóico há 3500 Ma. Os níveis de

exposição ao H2O2 (figura 18a), previstos para as zonas próximas da superfície dos

oceanos arqueozóicos (até 20 m), são superiores ao limite de toxicidade determinado para fitoplâncton e bactériofitoplâncton (Xenopoulos e Bird 1997). Estas previsões, em comparação com o trabalho de Xenopoulos e Bird (1967), apoiam a ideia que a pressão selectiva exercida para a evolução do Catalase tenha sido exercida pelo H2O2 exógeno,

principalmente junto à superfície. É de notar que no estudo de Xenopoulos e Bird (1967), os organismos utilizados eram nativos, possuíam sistemas antioxidantes, expressavam Catalase e que para valores de exposição superiores a 50 nM, observou-se sinais de stress oxidativo pela inibição da proliferação celular. Em analogia com estes organismos e tendo em conta as previsões do modelo, os organismos fotossintéticos ancestrais que não possuíssem qualquer tipo de defesa antioxidante para os efeitos do H2O2, estariam sob elevado stress oxidativo, quando se encontrassem em zonas junto da

superfície dos oceanos arqueozóicos. No entanto, para as zonas intermédias dos oceanos (50-100 m), não é possível precisar se estes organismos estariam sob condições de stress oxidativo. Contudo, poderá colocar-se a questão: será que poderiam estar protegidos do

77 stress da superfície? Seria uma hipótese, visto que a radiação visível fotossinteticamente activa penetra no máximo até aos 165 m (Piazena, et al. 2002). Contudo, nos oceanos não existem barreiras que limitem as zonas intermédias da superfície e as correntes de circulação da água nos oceanos constantemente transportam massas de água que levariam as células ancestrais das zonas intermédias para a superfície, colocando-as em stress oxidativo. Assim sendo, as células que possuíssem sistemas de protecção relativamente ao H2O2 seriam seleccionadas nesse local por um processo de selecção

natural por parte do H2O2 presente no ambiente.

Com base nas previsões do modelo cinético, o grande aumento de O2 na atmosfera

há 2300 Ma, levou ao aumento do potencial de peroxidação (figura 21e) lipídica e um segundo aumento na formação de H2O2 exógeno na zona fótica do oceano (figura 21a).

Estas alterações ambientais são originadas pelo aumento para 1% do O2 presente na

actualidade, durante a evolução, em combinação com a concentração do radical HOO● no oceano proterozóico, que é cerca de 102 vezes superior aos actuais. Assim sendo, os organismos vivos residentes nestes habitats, teriam que se adaptar ao aumento dos níveis exógenos de H2O2 em conjunto com a acumulação de peróxidos orgânicos

resultantes do processo de peroxidação lipídica nas suas membranas. Estas previsões, vão de encontro com a origem tardia na evolução dos peroxidases PRX e GPX há (2,6 ± 0,3) 103 Ma e (2,4 ± 0,4) 103 Ma respectivamente. A evolução destes enzimas aparenta estar relacionada com o aumento do potencial de peroxidação lipídica e do H2O2, pelo

que estes possuem actividade catalítica com o H2O2 e com peróxidos orgânicos

(LOOH). No entanto, a pressão selectiva para a evolução destes enzimas, pode ter tido uma importante contribuição por parte da formação endógena de H2O2 e ROOH, pelo

emergente metabolismo aeróbio há 3000-2500 Ma. É de notar, que a separação evolutiva verificada entre o GPX e o GSH é de cerca 1000 Ma. Em termos probabilísticos, a evolução do sistema bioquímico composto pelo GSH e o GPX é facilitado pela existência prévia do GSH em abundância. A disponibilização do GSH para este fim, é apoiada pela diminuição no potencial reactivo com proteínas do ambiente oceânico numa ordem de grandeza, previsto pelo modelo durante a acumulação de O2 na atmosfera há 2300 Ma.

A análise dos perfis de exposição às ROS e potencial de reacção com biomoléculas nos oceanos ao longo da evolução, traçados com base no modelo cinético desenvolvido, colocam o ambiente junto à superfície, durante a exposição à radiação UV solar, como a situação de maior potencial de stress oxidativo para os organismos vivos aquáticos. A

78 análise de sensibilidade efectuada ao modelo cinético no cenário da superfície do oceano arqueozóico (3500 Ma atrás) e actual, permitiu-nos identificar quais as reacções mais importantes para a formação das ROS (figura 16) e quais os parâmetros do modelo que afectam significativamente a concentração das ROS nestes ambientes. Surpreendentemente, a análise de sensibilidade às constantes cinéticas mostrou que a

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