As serpinas são proteínas inibidoras de serino peptidases e, em insetos, a maioria delas é descrita atuando no sistema imune pela regulação negativa da atividade de peptidases que desencadeiam a melanização dos tecidos, assim como a síntese de peptídeos anti-microbianos. A melanização é um processo desencadeado por ferimentos na cutícula ou pela infecção por micro-organismos, e pode levar à recuperação do tecido danificado, encapsulamento de micro- organismos invasores e produção de intermediários tóxicos (Ashida e Brey, 1998). Nesse processo imune, uma série de peptidases é recrutada sequencialmente, sendo que a fenoloxidase é a última enzima da cascata e encontra-se constitutivamente na hemolinfa na forma de zimogênio, como a profenoloxidase (Nappi e Ottaviani, 2000).
A ativação da profenoloxidase se dá pela ação de serino peptidases específicas, que são sintetizadas na forma de zimogênio. Essas serino peptidases, uma vez ativadas, também são inibidas por inibidores específicos que modulam a melanização e o processo imune. Sem esses inibidores, a toxicidade dos compostos de oxigênio reativos e quinonas geradas pela ação sistêmica e descontrolada da fenoloxidase pode ocasionar a morte do inseto (Soderhall e Cerenius, 1998). As serpinas são as proteínas chave que atuam na regulação dessas serino peptidases ativadoras da profenoloxidase em insetos (De Gregório et al., 2002; Ligoxygakis et al., 2002) e também participam das cascatas envolvidas na coagulação e resposta inflamatória em mamíferos (Gettins, 2002).
Outros estudos, fundamentalmente em lepidópteros, indicam também a participação de outras serpinas, muitas vezes chamadas de serpinas 1, em processos relacionados ao desenvolvimento ou ciclo de muda desses insetos. Esses inibidores são regulados negativamente pela presença da ecdisona, o hormônio da muda dos insetos, a qual é liberada no período que antecede à mudança de ínstar. Ao contrário da Spn27a de Drosophila, essas serpinas não têm a expressão gênica reprimida pelo inóculo de bactérias, o que aparentemente implica em não envolvimento nos processos imunes (Kanost et al., 1995; Chamankhah et al., 2003; Zheng et al., 2009). Entretanto, para esses insetos os estudos têm caráter mais descritivo e, em nenhum deles, foi avaliado o efeito funcional em insetos mutantes ou silenciados para essas serpinas.
A serpina 1 de S. levis (Spn1), ou Leviserpina, é um dos genes mais dissimilares identificados no transcriptoma, descrito no capítulo 1. Inicialmente foi detectado por meio de RT-PCR a expressão constitutiva desse inibidor em todas as fases do desenvolvimento analisadas, ovos, três fases larvais, pré-pupas, pupas e adultos. Os níveis de expressão são crescentes durante o desenvolvimento larval, atingindo a expressão máxima nas pupas (Fonseca et al., 2011). Considerando o baixo nível de conservação da sequência gênica, mesmo entre coleópteros, esse gene pode constituir um alvo altamente específico pelo silenciamento via RNAi.
A serpina 27a de Drosophila melanogaster (Spn27A) atua na inibição da melanização e desaparece da hemolinfa quando o inseto é infectado por micro- organismos. Em mutantes de Drosophila, a ausência dessa serpina na hemolinfa, tanto em larvas quanto adultos, causa melanização espontânea em taxas muito
elevadas decorrente da atividade constitutiva da fenoloxidase. Em homozigotos deficientes para Spn27a, obtidos a partir de cruzamentos dos mutantes, foi detectado que a maioria dos insetos morre antes de completar o estágio pupal (De Gregório et al., 2002; Ligoxygakis et al., 2002).
A expressão da Spn27a foi detectada por RT-PCR em todos os estágios do desenvolvimento de Drosophila, assim como a nível traducional, com anticorpos específicos, exibindo uma maior expressão nas pupas (De Gregório et al., 2002). A expressão constitutiva confirma que essa serpina é o gatilho da resposta imune. Na presença de bactérias ou fungos, os níveis de expressão da serpina caem drasticamente e o inibidor é exaurido da hemolinfa, disparando a resposta imune que leva à melanização em decorrência da atividade da fenoloxidase (De Gregório et al., 2002; Ligoxygakis et al., 2002).
A baixa conservação da sequência de aminoácidos da Spn1 de S. levis torna difícil e arriscada a identificação dos ortólogos ou homólogos funcionais entre outros insetos, até mesmo entre coleópteros. Entretanto, baseando-se no perfil de transcrição constitutivo, observado para a Spn1, similar àquele da Spn27a de Drosophila, inicialmente foi considerada a possibilidade de que a Spn1 poderia constituir o gene ortólogo da Spn27a em S. levis, constituindo um alvo potencialmente letal e específico para o silenciamento gênico. A observação de fenótipos letais para mutações em outras serpinas Spn28Dc, Spn42Da, Spn43Ac, Spn77Ba de D. melanogaster indica que a função desses inibidores não é redundante (Garret et al., 2009) e reforça a possibilidade da serpina 1 de S. levis constituir um alvo eficiente, independente da homologia funcional com a Spn27a.
3.2 Materiais e métodos
Todo o trabalho desenvolvido e apresentado nesse capítulo foi desenvolvido em duas etapas. A primeira fase foi conduzida sob a supervisão do Prof. Dr. John A. Gatehouse e desenvolvida na Universidade de Durham, Reino Unido (School of Biological and Biomedical Sciences, Laboratory of Crop Protection) no período de outubro de 2010 a fevereiro de 2011. Nessa etapa, foi realizada a seleção dos genes, para o silenciamento de S. levis e avaliação da resposta ao RNAi. Os genes escolhidos para verificar a sensibilidade do inseto ao RNAi, V-ATPase E e serpina,
também constituem potenciais alvos para o controle do inseto. Estes genes, provenientes de S. levis, e os prováveis ortólogos identificados para Tribolium castaneum, foram clonados para a produção dos dsRNAs, que foram injetados em larvas de T. castaneum, com o objetivo de avaliar a especificidade do RNAi, baseada na similaridade de sequência entre essas espécies de coleópteros. Na segunda fase, conduzida no Laboratório de Biologia Molecular, (UFSCar - São Carlos, Brasil) larvas de Sphenophorus levis foram injetadas com dsRNAs da V- ATPase E e serpina, produzidos apenas a partir das sequências gênicas provenientes desse inseto.