Um clone de cDNA que codifica uma cisteíno peptidase tipo catepsina L, denominado Sl-CathL, foi isolado da biblioteca de larvas de S. levis apresentada no capítulo 1. Este clone corresponde a uma das isoformas da enzima mais abundante identificada no transcriptoma, a qual é representada por 10,49% do total de ESTs
analisados ou 50,65% dos clones que codificam prováveis enzimas digestivas. A ORF de 972 pb, depositada no GenBank sob o número de acesso FJ467290, codifica uma pré-pró-enzima (Sl-CathL) homóloga a outras enzimas digestivas tipo catepsina L identificadas no intestino médio de outros coleópteros. A sequência protéica desta enzima apresenta 60% de identidade com a catepsina L de Diaprepes abbreviatus (ABG73217.1), 58% com Hypera postica (AAD41105.1) e 46% com a catepsina L de Tribolium castaneum (NP_001163996.1). O alinhamento representado na figura 2.6 destaca os resíduos e motivos conservados entre essas sequências de catepsinas L de coleópteros.
Figura 2.6: Alinhamento da sequência protéica da Sl-CathL (ACK38176) com catepsinas L homólogas de coleópteros. Resíduos conservados, idênticos em todas as proteínas são destacados em caixas pretas, enquanto as caixas brancas mostram os resíduos com mais de 50% de identidade entre as sequências. O peptídeo sinal da Sl-CathL aparece sublinhado em preto e o provável ponto de clivagem da pró-região é indicado por uma seta. O motivo inibitório conservado da pró-região "E-R-F- N-I-N" está destacado em uma caixa cinza acima do alinhamento. Os resíduos de aminoácidos envolvidos na catálise são indicados com asterisco (*) acima do alinhamento, que foi realizado utilizando o programa Multalign utilizando parâmetros padrões (Corpet, 1988).
Sabendo que as catepsinas L constituem enzimas originalmente lisossomais, Cristofoletti e colaboradores (2005) conduziram o primeiro estudo gerando fortes evidências de que essa classe de enzimas é secretada no lúmen do intestino das larvas do coleóptero Tenebrio molitor, e provaram a atuação dessas enzimas como verdadeiras enzimas digestivas. Utilizando anticorpos específicos e, também
realizando análises de RT-PCR, os autores provaram que a CAL2 (AY337517) e CAL3 (AY332272) são fundamentalmente produzidas no intestino médio das larvas do besouro, enquanto outras três isoformas da CAL1 (a: AY207373; b: AY332270; c: AY332271) foram detectadas em corpo gorduroso e outros tecidos, atuando portanto como enzimas lisossomais. Esses resultados sugerem, segundo os autores, que as catepsinas L digestivas de coleópteros provavelmente originaram-se por um processo de duplicação gênica e evolução independente a partir das catepsinas lisossomais. Em uma análise de similaridade com essas enzimas de T. molitor, a Sl- CathL apresenta maior similaridade com a CAL3 (63% de similaridade) do que com a CAL2 e isoformas da CAL1, (respectivamente 55% e 56%). O alinhamento evidenciando as identidades destas sequências é também representado na figura 2.6. Um cladograma das mesmas sequências de T. molitor e Sl-CathL gerado pelo alinhamento utilizando os parâmetros padrões do Blastx, seguido de uma análise pelo método Neighbor Joining (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/treeview), agrupou a Sl-CathL mais próxima à CAL3 e também CAL2, uma das raras catepsinas L comprovadamente digestivas, enquanto as isoformas de CAL1 foram agrupadas em um ramo separado formado apenas pelas catepsinas lisossomais (Figura 2.7).
Figura 2.7: Cladograma representando o agrupamento entre a Sl-CathL e as CALs (Catepsinas L) de
T. molitor. Note que a Sl-CathL é agrupada junto à CAL3, e também à CAL2, uma das raras
catepsinas L comprovadamente digestivas, enquanto as isoformas de CAL1 estão agrupadas em um ramo separado formado apenas pelas catepsinas lisossomais.
Nenhuma alta similaridade foi observada entre a sequência de proteína da Sl- CathL contra catepsinas de Lepidópteros, que não possuem a versão digestiva
dessa enzima. Os resultados dessas análises, junto aos poucos estudos de catepsinas L digestivas de insetos, nos motivaram a clonar e caracterizar a rSl-CathL além de comprovar a atuação no intestino médio como uma verdadeira enzima digestiva.
O clone de cDNA da Sl-CathL codifica uma pré-pró-enzima com um peptídeo sinal predito, composto por 16 aminoácidos (MKSFILASLLVVAVSA), indicado pela análise no programa SignalP 3.0 (Bendtsen et al, 2004). A clivagem desse peptídeo resulta em uma pró-enzima composta por 308 aminoácidos de massa molecular estimada em 34.26 kDa. A sequência completa da proteína foi analisada nos programas NetNGlyc 1.0 (Gupta et al., 2004) e NetOGlyc 3.1 (Julenius et al., 2005) para verificar a existência de prováveis sítios de glicosilação, entretanto, nenhum sítio foi identificado. Esses resultados apontam, mais uma vez, para a atuação digestiva da enzima, desde que catepsinas L lisossomais necessitam de resíduos de lisina especialmente dispostos na superfície da proteína, responsáveis pela fosforilação seletiva da manose que são necessárias para o endereçamento lisossomal (Cuozzo et al., 1998).
A Sl-CathL é produzida como zimogênio, e o motivo conservado "E42R46F50N53I57N61" do pró-domínio envolvido na inibição da atividade da enzima (Karrer et al., 1993), característico das enzimas papain-like é destacado na figura 2.8, junto à outras características da enzima. A tríade catalítica Cys138, His272 e Asn292 mostra-se conservada entre as sequências de catepsinas L de coleópteros evidenciadas na figura 2.6, assim como o resíduo de glutamina (Gln132) que precede a cisteína do sítio ativo (Cys138) e provavelmente auxilia na formação da cavidade do oxiânion. A asparagina (Asn292) participa da catálise orientando o anel imidazólico da histidina catalítica (His272) (Rawlings e Barrett, 1994).
A sequência de 924 pb da Sl-CathL, excluindo o provável peptídeo sinal, foi subclonada no plasmídeo pPICZαC para expressão recombinante. A pró-região predita da proteína (InterPro domain IPR013201) se estende do resíduo 17 ao resíduo 113, enquanto a proteína madura provavelmente compreende os resíduos 114 a 324 (Figura 2.8). O potencial ponto de clivagem entre o pró-peptídeo e a proteína madura ocorre na sequência “LADGVS*VPESIDWR”, resultando em uma valina (Val114) na extremidade N-terminal da enzima madura, e está de acordo com o observado para vários membros da família papaína, onde uma prolina (Pro115) é
conservada na posição 2 da enzima madura, provavelmente evitando a degradação da enzima (Rawlings e Barrett, 1994).
Figura 2.8: Sequência de aminoácidos da Sl-CathL (FJ467290). O provável peptídeo sinal de 16 aminoácidos está indicado em preto na extremidade N-terminal. A região marcada em cinza evidencia o pró-domínio predito, que se estende até a posição 113. O motivo inibitório conservado da pró-região E42R46F50N53I57N61 é está destacado em caixas brancas na pró-região. Os resíduos conservados da tríade catalítica: Cys138, His272, Asn292 estão destacados em caixas escuras, enquanto o resíduo de glutamina (Gln132), também envolvido na catálise, é indicado por um asterisco.
Soares-Costa e colaboradores (2011) purificaram duas cisteíno peptidases a partir do conteúdo do intestino de larvas de S. levis. As duas isoformas, que apresentaram atividade contra o substrato Z-Phe-Arg-AMC, comumente empregado para verificar a atividade de catepsinas L e correspondem à uma única banda de proteína que apresenta massa molecular em torno de 34 kDa. A fração de proteína purificada foi submetida a análises de espectrometria de massa após digestão tríptica (Dellamano, 2009; Fonseca et al., 2012) e os dados obtidos revelaram três peptídeos (A) VPESIDWR, (B) NVVTPIK e (C) DYWLIK, que foram identificados na sequência da Sl-CathL, indicando que ela é produzida no intestino e constitui uma enzima digestiva (Figura 2.9). Os peptídeos deduzidos na análise de espectrometria, correspondentes à proteína purificada, também foram localizados em outras sequências de catepsinas L identificadas a partir da análise do transcriptoma, correspondentes a isoformas dessa enzima. Esses resultados indicam que a proteína purificada do intestino pode corresponder a um conjunto de isoformas da Sl-CathL, considerando a abundância dessas variantes na biblioteca.
Figura 2.9: Sequência da Sl-CathL (ACK38176), evidenciando os peptídeos (A) VPESIDWR, (B) NVVTPIK e (C) DYWLIK, previamente identificados nas análises de espectrometria de massa a partir da proteína nativa purificada do intestino das larvas do inseto (Dellamano, 2009; Fonseca et al., 2012). Esse resultado indica que a Sl-CathL é de fato, uma enzima digestiva produzida no intestino. A seta indica o provável sítio de clivagem da pró-região.
A seta da figura 2.9 indica o provável sítio de clivagem da pró-região da Sl- CathL, que é corroborado pelo fato do peptídeo A (VPESIDWR) constituir um peptídeo não tríptico, pois é precedido de um resíduo de serina e não de um resíduo de arginina positivamente carregado, como esperado para uma clivagem tríptica. Isso indica que a clivagem desse peptídeo corresponde ao N-terminal da proteína madura e não da digestão tríptica realizada para a análise de espectrometria de massa, confirmando o sítio de clivagem predito descrito anteriormente para a pró- região da enzima.
Em análises de Western blotting, realizadas após a produção e ativação da enzima recombinante, é evidente o aparecimento de uma banda de massa molecular inferior, que pode corresponder à enzima madura, com a sua pró-região liberada. Essa banda foi recortada da membrana de PVDF e submetida ao sequenciamento da região N-terminal da proteína madura. Entretanto, as amostras não geraram sinal no sequenciador de proteína, o que pode indicar que a região N- terminal dessa proteína possa estar bloqueada.
Na seção 2.3.4 é mostrado que a rSl-CathL é capaz de se auto-ativar quando incubada em baixa temperatura e em pH inferior a 5,0. Curiosamente, o sítio predito de clivagem da pró-região “LADGVS*VPESIDWR” não está de acordo com a especificidade esperada para um substrato de catepsinas L. Para as catepsinas L (CALs) de T. molitor, foi demonstrado que essas enzimas são processadas após os resíduos "VQ" (CAL1), "VR" (CAL2) ou "SK" (CAL3) (Cristofoletti et al., 2005). Esse processamento também não se encaixa no esperado para a especificidade de catepsinas L, caracterizado pela preferência de um resíduo hidrofóbico em P2 e um aminoácido carregado positivamente em P1 (K ou R). As razões para essa aparente inespecificidade não são certas, mas provavelmente outros resíduos de aminoácidos
próximos ao sítio de clivagem podem estar envolvidos na especificidade da enzima, como previamente detectado para tripsinas de insetos (Lopes et al., 2006).
O peptídeo C (DYWLIK) identificado na sequência da Sl-CathL também não constitui um resíduo tríptico, uma vez que é precedido por uma lisina, e não uma arginina. Entretanto, esse peptídeo pode ser considerado um fragmento tríptico de uma variante da Sl-CathL, denominado "Sl-CathL isoforma b" (GenBank: JN815315) que também foi identificada em abundância na biblioteca e compartilha 98% de identidade de aminoácidos com a Sl-CathL, cujo clone foi utilizado para a expressão recombinante (FJ467290). A sequência de proteína da isoforma b é precedida por uma arginina no fragmento peptídico “DYWLIK”, podendo constituir uma das abundantes variantes de proteína do intestino da qual esse peptídeo foi originado.
Esses resultados estão de acordo com o perfil previamente identificado por Soares-Costa e colaboradores (2011) que relatam a atividade de cisteíno peptidases do intestino provenientes de, ao menos, duas isoformas, e corroboram a sugestão de que insetos fitófagos possuem uma ampla variedade de enzimas digestivas para contornar as deficiências causadas pela ingestão de inibidores produzidos pelas plantas como estratégia de defesa.