Os anticorpos policlonais produzidos em camundongos para a catepsina L foram eficientes contra a proteína recombinante até a diluição 1:40000. Na figura 2.18B é mostrada uma análise de Western blotting realizada com o anticorpo anti- rSl-CathL utilizado na diluição 1:10000. O anticorpo mostrou-se altamente específico, reconhecendo apenas a enzima recombinante no meio de cultura e eficiente também para a detecção da enzima nativa no extrato de proteínas do tubo intestinal das larvas S. levis, mostrada na canaleta 5. Este resultado indica que a enzima é de fato digestiva e está presente no conteúdo intestinal da larva do inseto. A especificidade do anticorpo detectada para a enzima nativa possibilitou sua utilização em ensaios histológicos, para verificar a expressão desta enzima ao longo do intestino médio.
Figura 2.18: Imunodetecção da rSl-CathL e da enzima nativa do inseto (A): Proteínas separadas em SDS-PAGE 15% carregadas em quantidades similares utilizadas na imunodetecção. (B): Proteínas transferidas para membrana de PVDF incubadas com anticorpos policlonais anti-rSl-CathL na diluição de 1:10.000. M: marcador de massa molecular; 1: controle negativo da expressão, 144 h após a adição de metanol (P. pastoris transformada com o plasmídeo sem inserto); 2: sobrenadante da indução da rSl-CathL 144 h após a adição de metanol ; 3: fração de enzima purificada em pH 8,0 (50mM de imidazol); 4: aproximadamente 12 µg da mesma fração purificada, após diálise em tampão fosfato de sódio, pH 8,0; 5: fração protéica extraída do conteúdo do tubo intestinal de S. levis. A seta preta indica a rSl-CathL como pró-enzima, enquanto a seta branca mostra a enzima nativa com a massa molecular idêntica à proteína purificada (Soares-Costa et al, 2011), com aproximadamente 34 kDa, reconhecida pelo anticorpo criado contra a proteína recombinante.
2.3.8.2 Caracterização morfológica do intestino das larvas de S. levis
O intestino das larvas desse inseto foi dissecado para caracterização morfológica. Foi observado que o tubo intestinal é constituído de um intestino anterior (IA) muito curto, um longo intestino médio (IM) dilatado na região anterior, enquanto o intestino posterior (IP) tem tamanho médio e diâmetro pouco reduzido quando comparado com o intestino médio (Figura 2.19).
Figura 2.19: Visão da morfologia do intestino de S. levis. Intestino anterior (IA), intestino médio (IM), intestino posterior (IP) e túbulos de Malpighi (TM). O intestino médio é mais dilatado na região anterior e foi subdividido em quatro ventrículos (V1, V2, V3, V4) de igual comprimento.
O intestino médio tem extensão média de 1,58 + 0,08 cm, com diâmetro aproximado de 0,2 cm na região anterior, que é reduzido para 0,06 cm na porção mais posterior. O intestino posterior se estende por aproximadamente 0,78 + 0.09 cm e seu diâmetro é de 0,05 + 0,005 cm. A extensão média do intestino anterior é de 0,11 cm. O intestino médio constitui um tubo contínuo, sem compartimentarização, esse ventrículo nesse estudo foi dividido em 4 regiões (V1-V4) para análise mais detalhada do perfil de produção da enzima catepsina L ao longo de sua extensão.
2.3.8.3 Imunolocalização da Sl-CathL por microscopia eletrônica de transmissão (MET)
Considerando que, de uma maneira geral, o intestino médio dos insetos é a principal região responsável pela produção de enzimas digestivas (Terra et al., 1985; Terra e Ferreira, 1994), para a imunolocalização da Sl-CathL foram preparados
cortes dos quarto ventrículos V1, V2, V3 e V4. Essa etapa do trabalho foi desenvolvida em colaboração com o Prof. Dr. Alberto de Freitas Ribeiro do departamento de Biologia do Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo. Na figura 2.20 pode ser observado que a proteína nativa foi eficientemente reconhecida pelo anticorpo nos cortes histológicos preparados a partir do epitélio intestinal. Nessa imagem é verificada a síntese da Sl-CathL nas células do epitélio e a formação de vesículas de secreção (V).
Figura 2.20: Imagem de microscopia eletrônica de transmissão indicando a produção da Sl-CathL nativa em uma célula epitelial do intestino médio de uma larva de S. levis. As partículas de ouro complexadas ao anticorpo secundário (anti-mouse IgG), possibilitam a visualização de pontuações escuras que correspondem à catepsina L nativa. A produção da enzima nativa ocorre no retículo endoplasmático rugoso (RE) com poliribossomos associados. As enzimas recém sintetizadas são direcionadas para o complexo de golgi (G), onde ocorre a formação de vesículas de secreção (V) contendo a enzima. Essas vesículas são exportadas até a base do epitélio, onde se fundem, liberando as enzimas digestivas na luz do intestino. M: mitocôndria.
Nas análises de imunolocalização ao longo do intestino (Figura 2.21) foi verificada a ocorrência da Sl-CathL em vesículas de secreção desde o primeiro ventrículo (V1) até o fim do intestino médio (V4). A produção da Sl-CathL em toda a extensão do intestino médio nas larvas de S. levis pode constituir uma sinapomorfia da espécie, considerando que segundo Terra e Cristofoletti (1996), a atuação das cisteíno peptidases em coleópteros ocorre fundamentalmente nos primeiros dois terços do intestino médio, devido à variação de pH ao longo do intestino que pode ser muito alcalino na região posterior.
Figura 2.21: Imunolocalização da Sl-CathL no intestino médio da larva de S. levis. As imagens da MET dos cortes dos quatro ventrículos indicam que a Sl-CathL é produzida em toda extensão do intestino médio, desde V1 até V4. As setas escuras indicam as vesículas de secreção marcadas com o anticorpo produzido em camundongos contra a proteína recombinante Sl-CathL.
Apesar destes resultados apontarem a produção da enzima ao longo de todo o intestino médio (V1-V4), esse não é um método quantitativo, e dados anteriores da atividade de cisteíno peptidases no intestino médio (Soares-Costa et al., 2011) sugerem que a secreção deve ocorrer principalmente nas porções iniciais do intestino (V1-V2). Esses resultados confirmam o importante papel dessa enzima na digestão nas larvas de S. levis, e evidenciam a possibilidade de utilizá-la como alvo para a inibição in vivo uma vez que ela pode ter sua atividade bloqueada diretamente pela ingestão de inibidores presentes na dieta do inseto.