O termo RNA de interferência foi proposto em 1998 por Fire e colaboradores, e desde a descoberta desse sistema, o RNAi vem sendo amplamente empregado como uma ferramenta genética. A produção de dsRNA correspondente à sequência do gene endógeno e a aplicação artificial no organismo por meio de injeções na cavidade corpórea, ou mesmo administração na alimentação, possibilita o silenciamento gênico específico. A análise dos fenótipos associados à perda de função do gene possibilita a dedução da função gênica, uma vez confirmada a queda da produção do RNAm específico. Essa tecnologia é perfeitamente aplicável a organismos não modelos, para os quais não foram desenvolvidos métodos específicos de transformação genética para o estudo de genômica funcional (Bellés, 2010).
Inicialmente descrito no nemátodo Caenorhabditis elegans (Fire et al., 1998), é agora evidente que a maquinaria de RNAi é evolucionariamente conservada entre a grande maioria das classes eucarióticas. Entretanto, a potência e eficácia do silenciamento gênico é extremamente variável, mesmo entre espécies próximas, o que reflete a variação nos mecanismos de tomada e propagação do sinal de RNAi. A concentração mínima de dsRNA necessária para causar o silenciamento gênico difere entre os organismos (Huvenne e Smagghe, 2010), possivelmente devido à variação na sensitividade dos componentes do sistema de interferência ou na eficiência dos sistemas de degradação extracelular para dsRNA (Bellés, 2010). O nível de transcrição do gene alvo, o turnover e a estabilidade do RNAm também são fatores que determinam a severidade do fenótipo gerado pelo silenciamento induzido (Rosso et al., 2009).
O fator que torna o RNAi uma ferramenta muito poderosa, inclusive aplicável ao controle de insetos, é que em plantas e em várias espécies animais o silenciamento gênico é transmitido sistemicamente, ou seja, o sinal é amplificado desde as células tratadas com dsRNA por todo o organismo. Contudo, em alguns organismos, a resposta é localizada apenas nas células expostas ao dsRNA devido à ausência de transportadores de dsRNA. Em C. elegans, o efeito do RNA de interferência pode ser gerado pela simples imersão dos vermes em solução contendo dsRNA, ou mesmo, pela alimentação administrando bactérias que expressam dsRNA (Fire et al., 1998).
No entanto, para os insetos de uma maneira geral, o método mais eficiente para o disparo do sistema de RNA de interferência se dá pela micro-injeção de dsRNA na cavidade corpórea (Bucher et al., 2002; Tomoyasu et al., 2008). No coleóptero Tribolium castaneum, tanto os ovos, larvas e adultos são sensíveis ao RNAi, permitindo estudos de expressão gênica durante todas as fases de desenvolvimento do inseto. Danos aos embriões podem ser evitados pela utilização de um método alternativo, o RNAi parental, que consiste na injeção de dsRNA na hemolinfa de fêmeas no estágio pupal, disparando o sistema de RNAi que é transmitido ativo para a próxima geração (Bucher et al., 2002).
Em Drosophila melanogaster, um dos organismos modelo mais bem estudados, grampos de RNAi são empregados para a super-expressão de dsRNA em tecidos e estágios específicos (Bellés, 2010). Isso porque esse inseto não apresenta uma resposta robusta de RNA de interferência mediado pela injeção de dsRNA. A disseminação dos efeitos de RNAi em Drosophila é diminuída nos estágios larvais e o RNA parental não foi efetivo para vários dos genes testados (Tomoyasu et al., 2008). Um método eficaz para absorção de RNAi na dieta desse inseto foi desenvolvido por Whyard e colaboradores (2009), no qual foram detectados os efeitos do silenciamento gênico via alimentação utilizando dsRNA de 29 a 40 pb encapsulados em lipossomos .
Em contraste, a praga dos grãos de cereais, Tribolium castaneum, além de ser o primeiro coleóptero que teve o genoma completo sequenciado (Richards et al., 2008), bem como o segundo inseto mais bem estudado, desenvolve uma forte resposta sistêmica à injeção de dsRNA. A discrepância entre a eficiência do silenciamento entre Tribolium e Drosophila é atribuída às diferenças na maquinaria protéica do sistema de silenciamento. As proteínas argonauta e proteína ligadora de dsRNA (dsRBM) são muito mais abundantes no genoma de Tribolium, e também acredita-se nas diferenças entre os domínios das isoformas da enzima Dicer entre esses dois insetos (Tomoyasu et al., 2008).
A administração de dsRNAs da V-ATPase E via alimentação se mostrou eficiente para o silenciamento gênico específico em insetos de diferentes ordens: T. castaneum (Coleoptera), Manduca sexta (Lepidoptera), Acyrthosiphon pisum (Hemiptera) e D. melanogaster (Diptera) (Whyard et al., 2009). Nos insetos, as moléculas de dsRNA administradas via alimentação são absorvidas no intestino
médio (IM), onde não ocorre o revestimento de quitina existente no intestino anterior (IA) e posterior (IP) (Figura 3.2A). No intestino médio, a absorção do dsRNA pelas células do epitélio é provavelmente mediada pelas proteínas transmembranas SID 1 e 2, assim como por mecanismos de endocitose (Huvenne e Smagghe, 2010) (Figura 3.2B).
Figura 3.2. Representação dos mecanismos de disparo da maquinaria de silenciamento gênico em insetos, via injeção ou ingestão de dsRNA. A: as moléculas de dsRNA administradas via alimentação são absorvidas no intestino médio (IM), a única região do intestino não revestida pela cutícula de quitina indicada em marrom no intestino anterior (IA) e posterior (IP) (adaptado de Gatehouse e Price, 2011). B: a absorção do dsRNA nas células do epitélio do intestino é mediada pelas proteínas transmembranas SID 1 e 2, assim como por mecanismos de endocitose. Os mecanismos de amplificação do dsRNA intracelular ainda não são conhecidos em insetos, devido à ausência de uma proteína homóloga da RNA depentende RNA polimerase (RdRP), responsável pela amplificação do sinal dos dsRNA que dispara a resposta sistêmica em micro-organismos, plantas e nemátodos (adaptado de Price e Gatehouse, 2008).
Em plantas, micro-organismos e no nemátodo C. elegans, poucos nanogramas de dsRNA são suficientes para o disparo de uma resposta sistêmica e persistente do RNA de interferência. Esse efeito é mediado pela ação da enzima RNA dependente RNA polimerase (RdRP), a qual é capaz de interagir com o complexo RISC e sintetizar novas moléculas de dsRNA a partir do RNAm degradado utilizando os siRNAs hibridizados como primers (Lipardi et al., 2001; Mello e Conte, 2004). No entanto, em insetos, os mecanismos de amplificação do dsRNA intracelular ainda não são conhecidos devido à ausência de uma proteína homóloga
da RdRP responsável pela amplificação do sinal. No besouro T. castaneum ocorre uma forte resposta sistêmica de silenciamento gênico até mesmo via alimentação (Whyard et al., 2009), porém as proteínas relacionadas à amplificação do sinal de RNAi ainda não foram identificadas mesmo com o genoma completo sequenciado (Gatehouse e Price, 2011) (Figura 3.2B).
Mesmo que os mecanismos de transmissão do sinal do RNA de interferência ainda não tenham sido completamente elucidados, a eficácia do RNAi sistêmico em T. castaneum tornou esse organismo uma espécie modelo para estudos de silenciamento gênico. Vários processos já foram investigados empregando RNAi incluindo o padrão de formação e segmentação durante o desenvolvimento embrionário, muda, via metabólica da síntese de quitina, percepção odorífera e ação molecular do hormônio juvenil (Tomoyasu et al., 2008; Bellés, 2010).