As proteínas no género de Candida desempenham diversas funções, como atividades hidrolíticas e enzimáticas que fornecem nutrientes e facilitam o estado das espécies como comensal ou como agente patogénico invasivo (Chaffin, 2008). Adicionalmente, a integridade da parede celular é claramente extremamente importante para a sobrevivência do microrganismo (Pitarch et al. 2002). A superfície da célula desempenha dois papéis, quer mantendo a integridade da célula quer interagindo com o ambiente envolvente, sendo um ponto de contato entre o microrganismo e o hospedeiro. Além do que, dado que as células de mamíferos não têm uma parede celular, esta estrutura celular poderia ser um local molecular promissor para pesquisar novos fármacos antifúngicos específicos (Pitarch et al. 2002). Para C. albicans, a parede celular tem sido um foco de atenção ao longo das últimas décadas, enquanto para C.
glabrata a informação é mais escassa.
A parede celular de espécies de Candida é principalmente constituída por polímeros de manose covalentemente ligados a proteínas ou glicoproteínas (manoproteínas, 30 a 40 %), polímeros de glucose (glucanos, 50 a 60 %) e quitina (0,6 a 9 %) (Pitarch, et al, 2002).
A parede de um fungo é um organelo dinâmico que serve de interface entre o fungo e o hospedeiro. Esta dá-lhe forma, confere proteção contra condições ambientais dentro do hospedeiro e medeia as interações hospedeiro-fungo que permitem o aparecimento de infeções. A parede fúngica é uma estrutura de camada dupla, em que a camada interna é constituída principalmente por moléculas de β-1,3-glucano, que é fortificada por ligações de hidrogénio e prolongada por moléculas de β-1,6-glucano, covalentemente ligadas. As moléculas de β-1,6-glucano podem também estar ligadas a cadeias de quitina. Estes três constituintes da parede formam uma rede flexível e tridimensional (Groot et al, 2008; Chaffin, 2008).
A parede é composta por uma rede interna de hidratos de carbono complexos e uma camada exterior de manoproteínas glicosadas, denominadas de proteínas da parede celular (cell wall proteins, CWP) covalentemente ligadas aos glucanos da parede. Existem duas classes de proteínas de parede (figura 1.6), as glicoproteínas dependentes de glicosilfosfatidilinositol (GPI-CWPs) e as proteínas Pir (proteins with internal
18
As paredes de Candida glabrata contêm GPI ligadas covalentemente à parede β- 1,6- glucano, bem como proteínas ligadas através de uma ligação ligeira alcalino- sensível a β-1,3-glucano. Existe ainda, em C. glabrata, uma terceira classe de proteínas que não possui uma ligação covalente à matriz de polissacáridos. Algumas destas proteínas podem estar distribuídas heterogeneamente pela superfície e podem não ter qualquer associação com o interior da célula. Fazem parte, também, da parede celular os fosfolipomananos com ligações β-1,2-manose (Groot et al. 2008; Chaffin, 2008).
Figura 1.6 - Representação esquemática dos principais componentes de Candida. A parede celular está localizada externamente à membrana celular (representada no fundo da imagem, a preto e branco). Os retângulos vermelhos representam as proteínas GPI e os hexágonos amarelos representam as proteínas Pir. As linhas azuis escuras representam os β-1,3-glucanos e as linhas azuis mais claras os β-1,6-glucanos. Os círculos castanhos representam os fosfatomanolípidos e os círculos verdes, proteínas soltas encontradas na parede celular ou no meio (retirado de (Chaffin, 2008)).
Uma das mudanças nos recentes anos é a aplicação de novas abordagens, não apenas para a expressão genética, mas também para a quantificação e identificação de proteínas e do seu metabolismo (Chaffin, 2008).
A proteómica surgiu com este mesmo objetivo de determinar a presença, abundância relativa e a modificação do estado de um conjunto de proteínas (Wilkins et al. 1995).
Esta técnica de pesquisa permite identificar, quantificar e caracterizar as proteínas sintetizadas nas células, tecidos ou organismos sobre diferentes condições, como condições e fatores de crescimento, stress, fármacos e doença (Wang et al; Taylor et al. 2000). Nem o código genético de DNA de um organismo, nem a quantidade de RNA mensageiro, que é expresso para cada produto genético (proteína), asseguram uma representação precisa do estado de uma célula viva, que pode ser alterado por várias
19
situações, como as referidas anteriormente. Assim, uma análise proteómica permite determinar as proteínas que foram condicionalmente produzidas, com que abundância e se algumas das modificações pós-translacionais foram afetadas. Desta forma, com este tipo de análise podem ser comparados dois ou mais estados de uma célula e também pode ser utilizada para tentar identificar mudanças proteicas específicas, a nível qualitativo e/ou quantitativo (Castle, et al. 2008).
O fracionamento reprodutível de misturas complexas de proteínas é um dos maiores desafios da análise proteómica, mantendo contudo, as relações qualitativas e quantitativas. O método que é recorrentemente usado para o desempenho desta tarefa com sucesso é a eletroforese em géis de poliacrilamida em duas dimensões, tendo-se tornado na ferramenta primária em investigação de proteómica.
Uma experiência em proteómica, como o estudo de perfis proteicos, é dividida em várias etapas. Inicialmente, é necessária a preparação e delineação da experiência, de modo a que os parâmetros chave sejam analisados, otimizados e revistos. De seguida, é feita a extração, fracionamento e solubilização de proteínas. As proteínas podem ser solúveis em citosol, inseridas em membranas celulares ou estarem ligadas a ácidos nucleicos ou outras proteínas. A escolha para o método de lise da célula e a composição do tampão de lise celular são os fatores principais que afetam diretamente a solubilização das proteínas. O método escolhido vai depender do tipo de microrganismo e pode ser um método de extração de proteínas mecânico ou químico. Os métodos mecânicos compreendem a sonicação com esferas de vidro para a lise das células. Enquanto no método químico é utilizada uma enzima, como a lisozima, para quebrar as paredes celulares. No que diz respeito aos tampões de lise, é da maior importância que contenham inibidores de proteases, para prevenir a degradação de proteínas que podem resultar na perda de proteínas de alto peso molecular. (Sousa, A., et al. 2014)
Após a solubilização das proteínas é feita a separação das proteínas num gel e, posteriormente, a sua imagem é adquirida e analisada, permitindo um isolamento e quantificação relativa das proteínas. É possível, após a excisão das proteínas do gel, fazer a sua identificação, recorrendo à espectrometria de massa e, finalmente, fazer também a caracterização funcional das proteínas identificadas (Castle, et al. 2008; Taylor, et al. 2000).
23
O objetivo principal deste trabalho visou aumentar o conhecimento inerente aos mecanismos de resistência de biofilmes de Candida glabrata. O trabalho foi dividido em três partes:
I. Estudar o comportamento de biofilmes pré-formados de C. glabrata após tratamento com agentes antifúngicos, nomeadamente fluconazol, voriconazol e anfotericina B.
II. Estudar a expressão de genes envolvidos na formação de biofilme e produção de matriz extracelular em C. glabrata e avaliar a sua importância na resistência ao fluconazol e ao voriconazol.
III. Estudar o perfil proteico de células de biofilme C. glabrata após tratamento com os antifúngicos fluconazol e voriconazol.
Pretendeu-se, assim, usando uma abordagem microbiológica, transcriptómica e proteómica identificar novos determinantes de resistência e consequente de virulência em C. glabrata.