Fish stocks

A formação de biofilme tem papel fundamental na patogenicidade de fungos. O desenvolvimento de biofilme em multicamada facilita a dispersão de células de C.

glabrata e a consequente colonização de tecidos do hospedeiro e/ou superfícies

abióticas. Além disso, o desenvolvimento de biofilme contribui para o aumento da resistência a agentes antifúngicos e, desta forma, ocorre a persistência de infeções (Riera,M., et al. 2012).

É sabido que um biofilme é cerca de 10 a 100x mais resistente que as suas células planctónicas (Douglas LJ., 2003). Assim, durante este trabalho experimental foi analisada a ação de três antifúngicos, nomeadamente do fluconazol, voriconazol e anfotericina B, no tratamento biofilmes de C. glabrata com concentrações referidas na secção 2.1.2 tendo em conta os valores MFC, a concentração mínima de antifúngico capaz de inibir o crescimento do microrganismo (tabela no Anexo A). Após tratamento dos biofilmes com os três agentes antifúngicos estes foram analisados pelo método de unidade formadora de colónias (UFC) (Figura 3.1) e pelo método de quantificação de biomassa total (figura 3.2).

L o g U F C /c m 2 Co ntr olo Flu co na zo l An fote ric ina B Vo ric on az ol 0 5 1 0 1 5 C o n t r o l o F l u c o n a z o l A n f o te r i c in a B V o r i c o n a z o l

Figura 3.1 - Número de células viáveis dos biofilmes de 48 h de Candida glabrata após tratamento com antifúngicos por mais 24 h. Fluconazol com uma concentração de 325 µg/mL, anfotericina B a 40 µg/mL e voriconazol com concentração de 100 µg/mL. Análise estatística utilizando o t-test.

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É de notar que utilização de qualquer um dos três agentes antifúngicos nestas concentrações não apresenta uma redução significativa do número de células viáveis do biofilme de C. glabrata, comparativamente ao biofilme sem tratamento (Figura 3.1).

Figura 3.2 - Valores de absorvância obtidos pelo método de violeta cristal usado para quantificação da biomassa total do biofilme de 48h de Candida glabrata, após tratamento com diferentes antifúngicos. Os antifúngicos utilizados, fluconazol, anfotericina B e voriconazol, apresentam-se a concentrações de 325 µg/mL, 40 µg/mL, 100 µg/mL, respetivamente. Análise estatística com t-test, onde (*) é um valor significativamente diferente, com p <0,05.

Através da análise da figura 3.2 relativa à quantificação da biomassa total verificou-se que os agentes antifúngicos apresentam comportamentos distintos. Tanto na presença de fluconazol como voriconazol verifica-se um pequeno aumento da biomassa total em relação ao biofilme de C. glabrata sem tratamento, embora não estatisticamente significativo (p>0,05). Contrariamente, o tratamento com anfotericina B apresenta uma redução significativa de biomassa total comparativamente com o controlo. De facto, verificou-se uma redução de aproximadamente 50 % no valor total da biomassa do biofilme.

É importante evidenciar que de um modo geral os dois métodos de avaliação do tratamento do biofilme de C. glabrata com os três agentes antifúngicos apresentam resultantes concordantes. Sabe-se que o violeta cristal é um dos primeiros métodos a ser

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adotado para a quantificação de biomassa dos biofilmes. Este método consiste em corar as moléculas carregadas negativamente, que após a coloração o violeta cristal é eluído através de um solvente, ácido acético. A quantidade de corante solubilizado pelo solvente é diretamente proporcional à biomassa. Contudo, este método apresenta uma fraca reproducibilidade, isto é, a condição experimental de crescimento do biofilme, a natureza e concentração do solvente e o tempo de eluição são passos fundamentais. Além disso, o corante não distingue células vivas de células mortas, não apresentando informação sobre o número de células vivas e, desta forma, a eficácia de agentes antifúngicos no biofilme é fracamente avaliada. De modo a ultrapassar este problema foi utilizado adicionalmente o método de unidade formadora de colónias (UFC) que contabiliza o número de células viáveis no biofilme (Hazan, R., et al. 2012; Pantanella, F. et, al. 2013). Através dos resultados obtidos nos dois métodos, no caso do fluconazol e do voriconazol não houve alteração quer do número de células viáveis, quer da biomassa total e quando foi utilizada a anfotericina B, observou-se uma redução do número de células viáveis (embora não significativa) e da biomassa.

Muitos isolados de Candida apresentam resistência inata ao fluconazol e o tratamento muitas vezes não é eficaz. A forma de biofilme, a forma mais prevalente de crescimento de microrganismos, confere à espécie de Candida um aumento de resistência ao tratamento com agentes antifúngicos (Donlan et al. 2002; Mukherjee et al. 2004). Assim, tal como o verificado para outras espécies de Candida também biofilmes de C.

glabrata analisados neste trabalho se apresentam extremamente resistentes ao

tratamento com antifúngicos. Segundo Shin et al. (2002) C. glabrata forma menos biofilme que outras espécies de Candida, no entanto a sua habilidade de formação, a sua estrutura e a composição da matriz são fatores importantes no que concerne à resistência dos antifúngicos. A presença e composição da matriz extracelular provocam uma barreira para a difusão de agentes antimicrobianos, uma vez que limita o acesso destes agentes aos organismos na base do biofilme, explicando porque pode não ocorrer a erradicação de biofilmes na presença de antifúngicos (Al-Fattani et al. 2006).

Além disso, em biofilmes maduros com alta densidade celular, existe uma heterogeneidade espacial entre as microcolónias e os canais de água, induzindo a resistência. Outra situação associada à densidade celular é a cooperação existente entre as células. Este fenómeno ocorre por processos quórum sensing, conferindo às células de biofilme a capacidade de coordenar o seu comportamento através de secreção de moléculas sinalizadoras (Ramage, G. et al. 2012). As bombas de efluxo podem estar

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também associadas ao aumento de resistência, uma vez que o número de bombas de efluxo e a sua função varia conforme o estágio de maturação do biofilme. Em fases mais avançadas do biofilme, a susceptibilidade a agentes antifúngicos diminui (Mukherjee, P., et al. 2004). Um outro fator importante envolvido no mecanismo de resistência aos agentes antifúngicos é o stress. Normalmente, mudanças na temperatura, stress iónico, mudanças osmóticas ou stress oxidativo causam um stress fisiológico em microrganismos patogénicos, como nas espécies de Candida. Quando estas fontes de

stress chegam aos recetores do hospedeiro, algumas vias de sinalização são

automaticamente ativadas, nomeadamente podem interferir na formação de biofilme e, consequentemente, na sua resistência a antifúngicos (Ramage, G. et al. 2012).

As leveduras da espécie de C. glabrata são normalmente sensíveis aos derivados de polienos, nomeadamente a anfotericina B, mas os seus efeitos tóxicos limitam o seu uso (Kiraz, N., et al. 2010). A anfotericina B tem como alvo o ergosterol fúngico, o componente principal da membrana celular. Os azóis são inibidores da enzima 14α- demetilase, bloqueando a produção de ergosterol, componente da membrana celular do fungo, desempenhando o seu papel no tratamento de candidíases. Contudo, o uso abrangente de fluconazol e outros azóis leva à ocorrência de novos casos de resistência a azóis. Também, o facto de C. glabrata ser um fungo haploide pode promover o desenvolvimento de uma resistência secundária. Além disso, a resistência cruzada com outros azóis ocorre, nomeadamente com voriconazol (Kiraz, N., et al. 2010).

Apesar da redução ocorrida com a utilização de anfotericina B, este agente antifúngico apresenta valores muito variáveis e um comportamento inconstante, pelo que no seguimento do trabalho apenas se utilizarão os agentes antifúngicos azóis, o fluconazol e o voriconazol.

De modo a perceber-se os fatores que envolvem a formação de biofilme de C.

glabrata e a produção de matriz extracelular podem estar associadas à resistência, foram

estudados na segunda parte deste trabalho genes associados à regulação destes mecanismos.

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