Nesta parte experimental foram estudados os perfis proteicos do proteoma total de células de biofilme de C. glabrata tratadas com dois agentes antifúngicos, o fluconazol e o voriconazol. Na sequência do trabalho anterior (secção 3.1) pretendeu-se não só estudar o perfil proteico de biofilmes de C. glabrata tratados com fluconazol e voriconazol como identificar e avaliar a presença das proteínas correspondentes aos genes estudados na secção 3.1.
Para cada condição em teste e após a extração do proteoma total, a quantidade de proteína total extraída foi quantificada (Tabela 3.1).
Tabela 3.1 - Média de proteína extraída de células de biofilmes de C. glabrata formados na presença e ausência de antifúngicos (fluconazol e voriconazol)
Média de proteína extraída (µg/mL)
C. glabrata sem antifúngico 1070,8
C. glabrata com fluconazol 1216,8
C. glabrata com voriconazol 1211,9
A quantificação de proteína extraída é de facto um passo fundamental para as etapas seguintes de eletroforese, quer unidimensional ou bidimensional, uma vez que é necessário ter a mesma quantidade de proteínas em todas as condições para se iniciar uma corrida e estabelecer comparações.
O perfil das proteínas obtidas foi avaliado em eletroforese unidimensal (1D) e bidimensional (2D), tendo sido posteriormente tratados os géis, através dos softwares Quantity One® e PDQuest, respetivamente.
3.3.1. Electroforese 1D
Quando se pretende verificar a presença ou ausência de proteínas, a coloração com nitrato de prata é a indicada, uma vez que permite constatar as variações qualitativas. À luz da literatura (Chevallet et al. 2007), a boa distinção das bandas e o seu número seriam de esperar utilizando nitrato de prata, devido à sua alta sensibilidade
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comparativamente aos outros métodos. Com esta coloração não é necessária tanta quantidade de amostra para correr os géis, bem como é possível utilizar amostras diluídas. A pureza da proteína também pode ser verificada e desta forma, os contaminantes são detetados com mais confiança. Dados estes fatores a coloração escolhida para este trabalho foi a coloração com nitrato de prata.
Com a utilização do software Quantity One® foi primeiramente identificado e contabilizado o número de bandas obtidas para cada condição da espécie de C. glabrata em estudo, apresentando-se os resultados resumidos na figura 3.5 e na tabela 3.2. É de notar que cada banda obtida por este método pode representar uma proteína ou um grupo de proteínas com o mesmo peso molecular.
Figura 3.5 - Imagem do gel obtida pelo software Quantity One® onde foram realizadas comparações do perfil proteico do proteoma total de células de biofilme de C. glabrata tratadas ou não tratadas com antifúngicos. A vermelho estão representadas as bandas correspondentes nas diferentes condições; a azul as bandas padrões, a verde o tipo de bandas conhecido e a amarelo bandas não classificadas.
Stand. Voriconazol Fluconazol Controlo
KDa 225 150 100 75 50 35 25
49 A tabela 3.2 sumariza o número de bandas identificadas no proteoma total de C. glabrata em diferentes condições obtidas pela eletroforese 1D.
Tabela 3.2 - Número de bandas identificadas do proteoma total de células de C. glabrata recolhidas de biofilmes crescidos em diferentes condições obtidas por eletoforese 1D, após coloração do gel com nitrato de prata e análise através do software Quantity One®
Número de bandas identificadas
C. glabrata sem antifúngico 16
C. glabrata com fluconazol 14
C. glabrata com voriconazol 19
Através da análise da tabela 3.2, constata-se, que o tratamento de biofilmes de C.
glabrata com agentes antifúngicos influencia a expressão de proteínas, em relação à
condição que não utiliza agentes antifúngicos. O proteoma total resultante das células de biofilme tratadas com voriconazol resulta num número adicional de 3 bandas em relação à condição controlo, por oposição ao tratamento do biofilme com fluconazol onde se identificou um número menor de bandas do que o controlo.
A tabela 3.3 identifica a percentagem de similaridade de bandas obtidas de células de biofilme de C. glabrata nas diferentes condições, obtidas por eletroforese 1D.
Tabela 3.3 - Percentagem de correspondência de bandas obtidas de células da estirpe C. glabrata ATCC nas diferentes condições, com os valores fornecidos pelos relatórios obtidos pelo software Quantity One Bandas Correspondentes C.glabrata controlo C.glabrata c/ fluconazol 86,67 % C. glabrata controlo C. glabrata c/ voriconazol 78,95 % C. glabrata c/ voriconazol C. glabrata c/ fluconazol 68,42 %
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A análise conjunta da figura 3.5 e a tabela 3.3 permite constatar que as percentagens de correspondência em todos os casos foram superiores a 50 %. A maior diferença a nível de percentagens de semelhança encontra-se na comparação do proteoma de células do biofilme tratados com os dois antifúngicos, no entanto ainda com uma correspondência de aproximadamente 68,42 %.
Esta diferença entre os dois agentes não era esperada uma vez que os antifúngicos da classe dos azóis, como o fluconazol e voriconazol, bloqueiam a síntese de ergosterol da parede de Candida, através da inibição do lanosterol 14α-demetilase, e tratando-se de dois azóis seria de esperar um comportamento semelhante. Apesar de que o voriconazol, como antifúngico mais recente, tem uma capacidade de inibição mais extensa (Greer, N. 2003). Adicionalmente, apesar do fluconazol e voriconazol terem uma estrutura semelhante, a maior diferença consiste na substituição de um grupo fluoropirimidina por uma porção triazol, o que poderá influenciar diferenças de comportamentos (Greer, N. 2003).
Esta análise proteica foi aprofundada com a elaboração de uma eletroforese 2D, de modo a obter-se com maior detalhe o perfil proteico das diferentes condições testadas.
3.3.2. Electroforese 2D
As proteínas extraídas das amostras em questão foram corridas numa primeira dimensão em IPG strips com diferentes gamas de pH, 3 a 10 e 5 a 8. É importante salientar que o uso de diferentes strips com intervalos de valores de pH mais apertados são a forma apropriada para mais facilmente distinguir as manchas e assim garantir uma melhor e mais correta identificação das proteínas.
Tal como para os géis obtidos pela técnica 1D também os géis obtidos por análise bidimensional foram corados com nitrato de prata, uma vez que esta coloração é descrita como uma das mais sensíveis e adequada na procura de presença ou ausência de proteínas, o que era pretendido nesta parte experimental do trabalho.
Inicialmente, foram tratadas as imagens provenientes do densiómetro com o
software PDQuest Advanced, tendo sido determinado o número de spots presentes em
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entre as diferentes condições de C. glabrata, proteoma total de células de biofilme após tratamento com fluconazol e voriconazol e na ausência destes.
O estudo comparativo entre as diversas condições, anteriormente referidas, utilizando IPG strips de pH 3-10 na estirpe de referência de C. glabrata encontra-se representado na figura 3.6.
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Figura 3.6 - Exemplo de imagens dos géis obtidas pelo software PDQuest do proteoma de células de biofilme de C. glabrata crescidas em diferentes condições em strips de pH 3-10. (A) C. glabrata sem agente antifúngico. (B) C. glabrata com fluconazol. (C) C. glabrata com voriconazol. A amarelo estão representados os spots assinalados para contagem pelo software.
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Com base nos relatórios obtidos pelo software foi possível identificar o número de spots em cada gel. Estes dados encontram-se resumidos na tabela 3.4.
Tabela 3. 4 - Número de spots detetados pelo software PDQuest nos géis relativos ao proteoma total de células de biofilme de C. glabrata com utilização de strips com pH 3-10, crescidos na presença e ausência de antifúngicos
pH 3-10 Número de spots
C. glabrata sem antifúngico 360
C. glabrata com fluconazol 366
C. glabrata com voriconazol 369
Esta tabela é indicativa que o perfil proteico obtido para cada uma das condições em análise não difere muito entre eles.
Como nestas condições não se verificou uma completa e total separação das proteínas (“spots”), como se pode verificar na figura 3.6, principalmente no centro do gel, as mesmas amostras foram corridas em IPG strips de pH 5-8 e géis obtidos novamente analisados (figura 3.7).
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Figura 3.7 - Imagens dos géis obtidas pelo software PDQuest de C. glabrata em diferentes condições com utilização de strips de pH 5-8. (A) C. glabrata sem agente antifúngico. (B) C.glabrata com fluconazol. (C) C.glabrata com voriconazol. A cor verde representa os spots comuns nos diferentes géis; as cores azul, vermelho e amarelo representam análises de T-test comparativas entre os géis efetuadas pelo software.
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Mais uma vez, e tendo como base os relatórios efetuados pelo software foi possível identificar o número de spots presentes em cada um dos géis, encontrando-se os resultados resumidos na tabela 3.5.
Tabela 3.5 - Número de spots detetados pelo software PDQuest nos géis do proteoma total de células de biofilme de C. glabrata com utilização de strips com pH 5-8, crescidas na presença e ausência de antifúngicos
pH 5-8 Número de spots
C. glabrata sem antifúngico 192
C. glabrata com fluconazol 284
C. glabrata com voriconazol 220
A análise da tabela 3.5 permitiu inferir que há um maior número de proteínas (spots) no proteoma total de células do biofilme tratados com fluconazol e voriconazol, comparativamente ao proteoma de células de biofilme de C. glabrata sem tratamento. Assim, é possível concluir que a presença de agentes antifúngicos no tratamento de biofilmes de C. glabrata resulta num aumento do número de proteínas expressas. De facto o proteoma das células de biofilme de C. glabrata tratadas com fluconazol apresenta mais 92 que o controlo e as tratadas com voriconazol, apesar de um número ser menor, apresenta apenas mais 28 que o controlo. Este software permite também identificar o número de spots comuns entre as diferentes condições, tendo-se obtido os resultados apresentados na tabela 3.6.
Tabela 3. 6 - Número de spots pelo software PDQuest e os spots correspondentes na estirpe de referência de C. glabrata na presença e ausência de agentes antifúngicos
C. glabrata Número de spots Spots correspondentes
Controlo 192 146 Fluconazol 284 Controlo 192 86 Voriconazol 220 Fluconazol 284 92 Voriconazol 220
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Assim, verificou-se maior similaridade, 146 spots, entre o proteoma de células de biofilme de C. glabrata tratadas com fluconazol e o biofilme não tratado. Por sua vez, a menor similaridade corresponde ao proteoma de células de biofilme de C. glabrata tratadas com voriconazol com a condição controlo, com 86 spots. Foi também realizado um estudo comparativo entre as diversas condições de crescimento dos biofilmes de C.
glabrata em estudo, tendo-se obtido os resultados presentes na tabela 3.7. É de notar
que software PDQuest apenas permite fazer comparações entre dois géis e, visto que foram identificados número de spots diferentes entre as diversas condições, as percentagens de correspondência apresentam-se também diferentes, consoante o gel escolhido como referência.
Tabela 3.7 - Percentagem de correspondência de spots de C. glabrata na presença e ausência de agentes antifúngicos, valores fornecidos pelos relatórios elaborados pelo software PDQuest
C. glabrata Controlo Fluconazol Voriconazol
Controlo - 50 % 39 %
Fluconazol 53 % - 41 %
Voriconazol 34 % 28 % -
A análise da tabela 3.7 e dos relatórios de comparação, fornecidos pelo software PDQuest, permitem constatar que o proteoma de células de biofilme de C. glabrata tratadas com fluconazol apresentam maiores percentagens de semelhança, cerca 53 % com o proteoma de células de biofilme de C. glabrata não tratadas com antifúngico e 41 % de similaridades com o proteoma de células de biofilme de C. glabrata tratadas com voriconazol. Por outro lado, o proteoma de células de biofilme de C. glabrata tratadas com voriconazol é a que apresenta menores percentagens de semelhança, com 34 % e 28 % para C. glabrata controlo e com fluconazol, respetivamente.
Avaliando os resultados obtidos pelos dois métodos eletroforéticos é possível observar que a maior percentagem de correspondência na eletroforese 1D (tabela 3.3) foi também obtida entre a comparação do proteoma de células de biofilme de C. glabrata não tratadas com as tratadas com fluconazol mas com uma percentagem de aproximadamente 87 %, enquanto na eletroforese 2D o maior valor é de 53 %. Na eletroforese unidimensional o proteoma das células de biofilme de Candida sem antifúngico e tratadas com voriconazol apresenta uma percentagem de correspondência
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superior com 78,95 % e na comparação entre os dois agentes antifúngicos também se verifica valores superiores com 68,42 %. Constata-se que existe uma diferença entre os valores de percentagem de semelhança entre os dois métodos, com a eletroforese unidimensional a apresentar percentagens mais elevadas em todos os casos. Constata-se que o número de proteínas detetadas para cada uma das condições das células de biofilme de C. glabrata em estudo é muito superior na eletroforese 2D do que na 1D. Isto é facilmente compreendido, uma vez que na eletroforese 2D a separação das proteínas ocorre de acordo dois parâmetros independentes, o seu ponto isoelétrico, numa primeira dimensão, e a sua massa molecular, numa segunda dimensão. Sabe-se que a eletroforese 2D tem uma capacidade de resolução de aproximadamente 10 000 proteínas em simultâneo, o que não acontece em qualquer método a uma dimensão, que somente tem uma resolução de aproximadamente 100 componentes proteicos (Castle, et al.; López, 2007). No entanto, ainda existem algumas limitações a superar pela eletroforese 2D, sendo exemplo a capacidade de analisar proteínas muito alcalinas, hidrofóbicas e/ou com baixa massa molecular com elevada resolução. Além disso, a existência de métodos de quantificação e comparação quantitativos das proteínas que sejam sensíveis, rápidos, simples, fiáveis e reprodutíveis. Por último, a simplificação e automação dos procedimentos de separação de proteínas (Bunai, et al. 2005; López, 2007).
À luz da literatura, a classe de agentes antifúngicos mais efetivos são os azóis, especificamente, o fluconazol e o voriconazol. Contudo, a existência de resistência aos azóis tem resultado em dificuldade de tratamento de candidíases (Il yoo et al. 2013). Neste estudo, verificou-se que há um aumento de expressão de proteínas na presença destes antifúngicos, fluconazol e voriconazol, contudo pequenas diferenças na estrutura molecular dos compostos e no seu mecanismo de ação podem ser causadoras de diferenças na expressão. Esta ação do metabolismo de C. glabrata é apontada em estudos de outros autores, embora o mecanismo do voriconazol ainda não seja bem compreendido (Il yoo et al. 2012; 2013).
Existem proteínas, tais como as codificadas pelos genes ZAP1, FKS1 e KRE, estudados anteriormente, que estão descritas como envolvidas na capacidade adaptativa de espécies de Candida ao estado de biofilme que deveriam ser identificadas ao longo deste trabalho experimental. Apesar de conhecido o seu ponto isoelétrico e o peso molecular FSKp1 (PM 213,9 kDa; pI 7,87), o ZAPp1 (PM 79,4 kDa; pI 6,99), o KREp1 (PM 38,4 kDa; pI 5,93) torna-se difícil a sua identificação no espectro proteico obtido
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(figura 3.8). Um estudo mais exaustivo seria assim necessário para melhorar a sua identificação. Contudo, após uma análise exaustiva dos géis obtidos podem identificar- se “spots” ou grupos de “spots” como potenciais candidatos aos genes em avaliação. Estes terão de ser removidos do gel, e após tratamento com tripsina e sequenciados por espectrometria de massa de forma a obter a sequência das proteínas.
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Figura 3.8 -Representação das possíveis proteínas expressas pelos genes FKS1, ZAP1 e KRE1. A vermelho está representada a proteína expressa pelo gene FKS1 (PM 213,9 e pI 7,87);a verde a proteína expressa pelo gene ZAP1 (PM 79,4 e pI 6,99) e a azul a proteína expressa pelo gene KRE1 (PM 38,4 e pI 5,93).