4.1 Fisheries and seafood
4.1.3 Fisheries management
Como anteriormente reportado, os mecanismos de resistência de biofilmes de C.
glabrata estão pouco estudados e desta forma este trabalho foi desenvolvido nesse
sentido.
No entanto, e tendo em conta os resultados obtidos neste trabalho é possível fazer algumas sugestões para futuras investigações:
I. Estudar o efeito dos agentes antifúngicos fluconazol, voriconazol e anfotericina B em células de biofilme de mais estirpes de C. glabrata.
II. Criar mutantes para os genes ZAP1 e KRE1 de forma a validar molecularmente os resultados obtidos durante este trabalho.
III. Identificar as possíveis proteínas envolvidas na capacidade adaptativa de C.
glabrata ao estado de biofilme recorrendo a espectrometria de massa, como
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Anexo A – Concentração mínima inibitória e concentração mínima
fungicida
É apresentado na tabela A.1 os valores de concentração mínima inibitória (MIC) e de concentração mínima fungicida (MFC) da espécie de C. glabrata, para três antifúngicos.
Tabela A.1 – Valores da concentração mínima inibitória (MIC) e da concentração mínima fungicida (MFC) da espécie de C. glabrata
Espécie Estirpe Fluconazol Voriconazol Anfotericina B
MIC (mg/mL) MFC (mg/mL) MIC (mg/mL) MFC (mg/mL) MIC (mg/mL) MFC (mg/mL) C. glabrata ATCC 2001 64 1250 0.5 1-2 2 2
82
Anexo B – Eficiência dos primers
São apresentados neste anexo as curvas (Figuras B.1, B.2, B.3) referentes às eficiências dos primers escolhidas, bem como as tabelas (B.1, B.2, B.3) com as diferentes temperaturas de melting e eficiências estudadas para os genes FKS1, ZAP1 e KRE1. A sublinhado a amarelo nas tabelas encontra-se a eficiência determinada e a temperatura de melting utilizada.
Figura B.1- Curva de eficiência dos primers do gene FKS1 à temperatura de 57,2°C.
Através da figura B.1 é possível observar a curva correspondente à temperatura de 57,2 °C para o cálculo da eficiência dos primers do gene FKS1.
Tabela B.1– Gradiente de temperaturas de melting estudadas para a determinação da eficiência do primers do gene FKS1
Temperatura (°C) Declive Eficiência
59 3,4747 1,939968
58 3,4183 1,961296
57 3,1425 2,080741
56 3,1857 2,060169
55 3,5412 1,915976
Na tabela B.1 observamos o gradiente de temperaturas de melting estudadas e a determinação da eficiência para os primers do gene FKS1. A sublinhado encontra-se a temperatura escolhida, 57°C, com uma eficiência de 2,08.
y = -3,1425x + 22,893 R² = 0,987 22 24 26 28 -1,600 -1,400 -1,200 -1,000 -0,800 -0,600 -0,400 -0,200 0,000 Ct Log10 ([DNA])
FKS1 57,2ºC
83
Figura B.2- Curva de eficiência dos primers do gene ZAP1 à temperatura de 57,2°C.
Através da figura B.2 é possível observar a curva correspondente à temperatura de 57,2 °C para o cálculo da eficiência dos primers do gene ZAP1.
Tabela B.2– Gradiente de temperaturas de melting estudadas para a determinação da eficiência do primers do gene ZAP1
Temperatura (°C) Declive Eficiência
58 3,5279 1,920679
57 3,7965 1,834005
56 3,9896 1,78095
55 3,5179 1,924246
54 3,6408 1,882196
Na tabela B.2 observamos o gradiente de temperaturas de melting estudadas e a determinação da eficiência para os primers do gene ZAP1. A sublinhado encontra-se a temperatura escolhida, 57°C, com uma eficiência de 1,83. Apesar de haver a temperatura de 58 °C com eficiência melhor, foi escolhida esta porque a diferença dos valores de eficiência não afetaria os resultados e assim teria a mesma temperatura do que o gene housekeeping, a actina.
y = -3,7965x + 21,784 R² = 0,9989 0 10 20 30 -1,200 -1,000 -0,800 -0,600 -0,400 -0,200 0,000 0,200 0,400 Ct Log10 ([DNA])
ZAP 57,2 °C
84
Figura B.3- Curva de eficiência dos primers do gene KRE1 à temperatura de 59°C
Através da figura B.3 é possível observar a curva correspondente à temperatura de 59°C para o cálculo da eficiência dos primers do gene KRE1.
Tabela B.3 – Gradiente de temperaturas de melting estudadas para a determinação da eficiência do primers do gene KRE1
Temperatura (°C) Declive Eficiência
59 3,5853 1,900714
58 2,4981 2,513647
57 2,2656 2,763021
56 1,9229 3,311676
Na tabela B.3 observamos o gradiente de temperaturas de melting estudadas e a determinação da eficiência para os primers do gene FKS1. A sublinhado encontra-se a temperatura escolhida, 59°C, com uma eficiência de 1,9.
y = -3,5853x + 29,443 R² = 0,9291 28 29 30 31 32 33 34 -1,200 -1,000 -0,800 -0,600 -0,400 -0,200 0,000 0,200 0,400 Ct Log10 ([DNA])
KRE1 59°C
85
Anexo C – Extração de proteínas
O processo de extração de proteínas por lise mecânica utilizando esferas de vidro foi otimizado. Foram realizados ciclos de 30 segundos com velocidade de 6,5 m/s com paragem de 30 ciclos para colocação das amostras em gelo, entre cada ciclo, como é possível observar na figura C.1.
Figura C.1 – Absorvância de proteína extraída do biofilme de C.glabrata ATCC 2001 por cada ciclo de lise (30 segundos) no FastPrep.
Através da figura C.1 é possível verificar que após o quinto ciclo é onde se encontra o máximo de libertação de proteína por parte da célula quando esta é lisada. Entre o quinto e o sétimo ciclo não existe uma grande variação de valores, pelo que o máximo de libertação de proteínas já fora atingido, tendo tendência para depois começar a decrescer
.
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 0 1 2 3 4 5 6 7 A b s 562 n mTempos de lise (30 seg)
86
Figura C.2- Utilização do método UFC para verificar a quantidade de células vivas por cada 30 segundos de ciclo.
Na figura C.2 é possível observar o decréscimo do número de células vivas à medida que aumentam o número de ciclos. Verifica-se que do ciclo quinto ao sétimo não existe variação do número de células vivas que, como visto na figura C.1, é onde se encontra o máximo na libertação de proteínas por parte da célula.
Desta forma, para a obtenção do máximo de proteína são necessários no mínimo cinco ciclos de 30 segundos na velocidade de 6,5 m/s. A partir deste ciclo, a quantidade de proteína extraída é aproximadamente a mesma.
0 2 4 6 8 10 12 0 1 2 3 4 5 6 7 Log UFC/m l
Tempos de lise ( 30 seg)
87
Anexo D – Curva de calibração de BSA
A curva de calibração foi realizada para a quantificação de proteínas. Na figura D.1 é representada a relação entre a concentração (µg/mL) de uma proteína (BSA) e a densidade ótica (562 nm).