5.3 Performance on Authentic Micro-CT Images
5.3.1 Oil-Wet Glass Beads
Como estão envolvidas na maioria dos processos celulares, incluindo a manutenção da estrutura proteica, as análises das PTMs têm se tornado um grande desafio às pesquisas proteômicas sendo requeridos métodos sensíveis e eficientes para a detecção das PTMs. Porém, a espectrometria de massas (MSn) tem demonstrado ser extremamente útil na
identificação das PTMs; e tem sido amplamente utilizada na identificação e caracterização de proteínas (Mann et al., 2003; Witze et al., 2007; Johnson e Eyers et al., 2010). Não existe uma estratégia universal para identificar as PTMs, e todas as abordagens utilizadas apresentam aspectos positivos, bem como algumas limitações. No entanto, a caracterização de PTMs por NanoLC-MSn é atualmente viável através da abordagem de espectrometria de massas (MSn),
utilizando um ou mais de um método de fragmentação como o CID (dissociação induzida por colisão) e o ETD (dissociação por transferência de elétrons), tanto para a determinação da sequência de aminoácidos, quanto para a determinação do tipo e localização de PTMs. A vantagem de se alternar o uso dos dois métodos de fragmentação torna se interessante, uma vez que ocorre uma complementariedade dos dados gerados por ambos.
Atualmente estudos têm utilizado a MSn em todas as suas abordagens e/ou a
combinação da MSn com outros métodos para a identificação e localização de PTMs nos mais
diversos estudos com as mais diversas amostras biológicas (Chen et al., 2010; Redeker, 2010; Britton et al., 2011; Bae et al., 2012; Heo et al., 2012; Resende et al., 2013; Dos Santos-Pinto et al., 2014). No presente estudo adotamos uma estratégia combinando a 2-DE com NanoLC-MSn
utilizando-se dois diferentes métodos de fragmentação, CID e ETD, para identificar e sequenciar as proteínas constituintes das fibras da seda da aranha N. clavipes; assim como
também, identificar e localizar as PTMs presentes nessas proteínas.
As tabelas 14, 15 e 16 mostram o mapeamento dos sítios de fosforilação, hidroxilação, glicosilação e nitrotirosina observados na sequência das proteínas espidroína-1, espidroína-2 e proteína da seda flageliforme, mostrando a posição dessas modificações na sequência e o método de fragmentação pelo qual foram observadas. Podemos notar que a maioria das PTMs foram observadas tanto por CID quanto por ETD, presentes nos fragmentos oriundos da digestão enzimática com tripsina e quimiotripsina, enzimas que apresentaram uma melhor fragmentação das espidroínas possibilitando uma elevada cobertura das sequências obtidas no presente estudo. Além disso, muitas dessas PTMs se repetem em fragmentos peptídicos de diferentes spots.
152 Tabela 14. Mapeamento dos sítios de fosforilação, glicosilação e nitrotirosina observados na sequência da proteína espidroína-1, a qual foi secretada pela glândula ampulada maior e identificada na seda produzida pela aranha N. clavipes.
PTMs Enzima fragmentação Método de Anexo dados referentes Fosforilação - código de acesso B5SYS5 / B5SYS6
T49 Tripsina/Quimiotripsina CID/ETD Tabela S3 (spots 3 e 5)
T53 Tripsina CID Tabela S4 (spot 6)
T62 Tripsina CID Tabela S4 (spot 6)
S95 Tripsina CID Tabela S3 (spots 3 e 4)
S119 Glu-C CID/ETD Tabela S3 (spot 5)
T127 Quimiotripsina CID/ETD Tabela S4 (spot 4)
S144 Glu-C CID Tabela S3 (spots 3 e 4)
S164 Quimiotripsina CID Tabelas S3 (spot 6); S4 (spot 6)
S170 Quimiotripsina CID Tabela S4 (spot 6)
S195 Quimiotripsina CID Tabela S3 (spot 4 e 5)
S211 Quimiotripsina CID Tabela S3 (spot 6)
S244 Quimiotripsina CID Tabela S3 (spot 6)
Glicosilação - código de acesso B5SYS6 N44 Quimiotripsina CID Tabela S4 (spots 3 e 5)
N237 Quimiotripsina CID Tabela S4 (spot 4)
Fosforilação - código de acesso P19837 Y31 Quimiotripsina CID Tabela S3 (spots 3 e 6)
Y59 Tripsina/Quimiotripsina CID/ETD Tabelas S1 (spot 2); S3 (spot 6)
S64 Tripsina/Quimiotripsina CID Tabelas S1 (spot 3); S3 (spots 3, 4 e 5)
Y89 Tripsina CID/ETD Tabela S1 (spot 1)
Y151 Tripsina CID/ETD Tabelas S1 (spots 2, 3 e 4); S3 (spot 6); S4 (spot 4)
S156 Quimiotripsina CID Tabelas S1 (spot 4); S3 (spots 3, 4, 5 e 6)
Y184 Tripsina/Quimiotripsina CID Tabelas S1 (spot 4); S3 (spot 4)
S243 Quimiotripsina CID/ETD Tabela S4 (spots 3 e 4)
S260 Quimiotripsina CID/ETD Tabelas S1 (spots 1, 3); S3 (spots 4, 5 e 6)
Y353 Tripsina CID/ETD Tabelas S1 (spot 2); S3 (spot 6)
Y387 Tripsina CID/ETD Tabelas S1 (spot 2); S3 (spot 6)
S462 Quimiotripsina CID/ETD Tabela S1 (spot 4)
Y478 Tripsina CID/ETD Tabelas S1 (spot 4); S3 (spot 6)
S523 Tripsina CID Tabela S3 (spot 4)
Y575 Tripsina CID Tabela S3 (spots 4 e 6)
S580 Tripsina/Quimiotripsina CID Tabela S3 (spots 3, 4 e 5)
Nitrotirosina - código de acesso P19837 Y18 Quimiotripsina CID Tabela S4 (spots 3 e 4)
153 Tabela 15. Mapeamento dos sítios de fosforilação observados na sequência da proteína espidroína-2, a qual foi secretada pela glândula ampulada maior e identificada na seda produzida pela aranha N. clavipes.
PTMs Enzima fragmentação Método de Anexo dados referentes Fosforilação - código de acesso P46804
S22 Quimiotripsina CID Tabela S1 (spot 4)
Y61 Proteinase 10 CID Tabela S1 (spot 4)
S116 Proteinase 10 CID Tabela S1 (spot 3)
S245 Quimiotripsina CID Tabela S1 (spot 3)
S383 Proteinase 10 CID Tabela S1 (spot 3)
T555 Proteinase 10 CID Tabela S1 (spot 3)
S601 Proteinase 10 CID/ETD Tabela S1 (spot 3)
S602 Proteinase 10 CID/ETD Tabela S1 (spot 3)
S603 Proteinase 10 CID/ETD Tabela S1 (spot 3)
Y609 Proteinase 10 CID Tabela S1 (spots 3 e 4)
S613 Proteinase 10 CID/ETD Tabela S1 (spots 3 e 4)
Tabela 16. Mapeamento dos sítios de hidroxilação, fosforilação e nitrotirosina observados na sequência da proteína da seda flageliforme, a qual foi secretada pela glândula flageliforme e identificada na seda produzida pela aranha N. clavipes.
PTMs Enzima fragmentação Método de Anexo dados referentes Hidroxilação - código de acesso O44359
P2 Quimiotripsina CID Tabela S4 (spot 2)
P17 Quimiotripsina CID Tabela S4 (spot 2)
P27 Quimiotripsina CID Tabela S4 (spot 2)
P37 Quimiotripsina CID Tabela S4 (spot 2)
P47 Quimiotripsina CID Tabela S4 (spot 2)
P57 Quimiotripsina CID Tabela S4 (spot 2)
P67 Quimiotripsina CID Tabela S4 (spot 2)
P382 Quimiotripsina CID Tabela S4 (spots 1 e 2)
P406 Quimiotripsina CID Tabela S4 (spot 2)
P415 Quimiotripsina CID Tabela S4 (spot 2)
P435 Quimiotripsina CID Tabela S4 (spot 2)
P460 Quimiotripsina CID Tabela S4 (spot 2)
P470 Quimiotripsina CID Tabela S4 (spot 2)
P480 Quimiotripsina CID Tabela S4 (spot 2)
P490 Quimiotripsina CID Tabela S4 (spot 2)
P500 Quimiotripsina CID Tabela S4 (spot 2)
P520 Quimiotripsina CID Tabela S4 (spot 2)
P530 Quimiotripsina CID Tabela S4 (spot 2)
Fosforilação - código de acesso O44359
T95 Proteinase 10 CID Tabela S3 (spot 2)
Y380 Quimiotripsina CID Tabela S3 (spot 1)
Y389 Quimiotripsina CID Tabela S3 (spot 2)
Nitrotirosina - código de acesso O44359
154
O método de fragmentação CID mostrou uma melhor fragmentação dos íons de carga 1 e 2+, enquanto que o ETD mostrou uma melhor fragmentação dos íons de carga 3+. No entanto,
os dados gerados foram utilizados de forma complementar, sendo possível detectar as PTMs nos fragmentos gerados por ambos, tanto CID quanto ETD. Apesar de o método ETD ser considerado eficiente para a detecção das PTMs, que são lábeis, como a fosforilação e glicosilação pela CID, no presente estudo essas modificações também foram observadas pelo método CID. A fosforilação nos resíduos de tirosina é considerada estável durante a fragmentação por MSn, enquanto que nos resíduos de serina e treonina apresenta uma
estabilidade moderadamente estável. Já a glicosilação e a nitrotirosina são consideradas de instáveis a moderadamente estáveis; e a hidroxiprolina é considerada estável (Mann et al., 2003; Wiesner et al., 2008; Johnson e Eyers et al., 2010; Drabik et al., 2012). Portanto, todas essas modificações são possíveis de serem detectadas por ambos CID e ETD.
Considerando-se a grande quantidade de espectros que foram gerados na identificação das sequências peptídicas de todas as proteínas oriundas da 2-DE da seda, e para que a redação da tese ocorresse de forma contínua, de modo que a sua leitura não fosse interrompida, todos os resultados de CID/ETD-MSn destacando as PTMs observadas em todas
as proteínas do presente estudo estão demonstrados no material suplementar, apêndices B - figuras S1-S63.
Até então, nenhum estudo utilizando a abordagem proteômica sobre as proteínas constituintes da seda de aranha havia sido publicado. Os estudos publicados sobre essas proteínas são principalmente oriundos de dados da engenharia genética e da tecnologia do DNA recombinante (Lewis, 2006; Rising et al., 2007; Lefèvre et al., 2011; Rising et al., 2011); dados sobre a variação polimórfica de resíduos de aminoácidos e PTMs, por exemplo, são limitados. Modificações como fosforilação (Michal et al., 1996) e glicosilação (Weiskopf et al., 1996; Sponner et al., 2007) têm sido relatadas na seda de aranhas, no entanto, até então não se conhecia a exata localização/posição dessas e de outras modificações na sequência das espidroínas. Recentemente publicamos parte dos resultados obtidos com a proteína espidroína- 1 da seda (somente o frame sem a teia orbital) da aranha N. clavipes do presente estudo,
juntamente com resultados obtidos com a seda (somente o frame sem a teia orbital) de outras duas espécies de aranhas, N. edulis e N. madagascariensis. Nesse estudo descrevemos oito
155
quatro sobre a espidroína-1 produzida pela N. madagascariensis, e dois sobre a espidroína-1
produzida pela N. edulis (Dos Santos-Pinto et al., 2014).
No presente estudo, as PTMs mais comumente estudadas, como fosforilação, glicosilação e hidroxilação, foram observadas nas sequências das proteínas constituintes da seda da aranha N. clavipes. A fosforilação é uma das PTMs mais comuns em proteínas e
consiste na fixação reversível de um grupo fosfato em um resíduo específico de uma proteína- alvo atuando na sinalização e na regulação da atividade proteica (Ribet et al., 2010). Em geral, a introdução de um ou mais grupos fosfato nos resíduos de serina, treonina e tirosina é conhecido por induzir mudanças conformacionais significativas e consequentemente ocasionar efeitos sobre a atividade e interação das proteínas (Eyers et al., 2008), e têm sido relatados em diferentes tipos de seda. Zhang et al. (2006) relataram a presença de sítios de fosforilação na fibroína de cadeia leve e P25, um dos três polipeptídeos componentes da fibroína da seda de
Bombyx Mori; e em estudos de Chen et al. (2010), também com a seda do casulo de Bombyx Mori, foram identificados 12 sítios de fosforilação presentes na fibroína de cadeia pesada.
Estudos demonstram a presença de uma grande quantidade de resíduos de fosfato no ducto de fiação sugerindo que a fosforilação ocorre durante o processamento da fibra para ser liberada pela glândula ampulada maior (Michal et al., 1996; Heim et al., 2009). Além disso, foi demonstrado que o alinhamento/dobramento das proteínas é regulado por alterações fisícas e bioquímicas que ocorrem ao longo do ducto de fiação, com uma diminuição de pH e concentração de íons Na+ e aumento na concentração dos íons K+ e fosfato (Knight et al., 2001;
Dicko et al., 2004; Askarieh et al., 2010). Winkler et al. (2000), demonstraram que o alinhamento/dobramento de folhas-β em proteínas semelhantes às proteínas da seda foi controlado pelas reações enzimáticas de fosforilação/desfosforilação. Foi proposto que os resíduos de serina, treonina e tirosina fosforilados desencadeiam a interação entre os motivos hidrofóbicos de polialanina, causando a agregação das espidroínas e outras proteínas da seda (Arakawa et al., 1985; Huemmerich et al., 2004).
Uma observação cuidadosa sobre a localização dos sítios de fosforilação observados na espidroína-1 e espidroína-2 do presente estudo, nos mostra que, a maioria dessas PTMs estão localizadas exatamente dentro dos motivos estruturais que seriam responsáveis pelas propriedades mecânicas da seda; na espidroína-1 a fosforilação foi observada principalmente no motivo GGX, o qual pode ser responsável pelas propriedades elásticas. Já na espidroína-2, a fosforilação foi observada nos motivos GPGXX e (A)n, os quais podem ser responsáveis pelas
propriedades elásticas e de resistência da seda, respectivamente. Estudos evidenciam que a estrutura constituída pelo motivo GGX pode formar folhas-β bem como estruturas helicoidais
156
menos organizadas (Lefèvre et al., 2007; Jenkins et al., 2010; Rising et al., 2011); enquanto que a estrutura constituída pelo motivo GPGXX, devido ao resíduo de prolina, forma claramente voltas-β que quando repetidos produzem uma estrutura em espiral (Hayashi et al., 1999; Eisoldt et al., 2011). O significado biológico da grande quantidade de fosforilação observada nas proteínas da seda da aranha N. clavipes do presente estudo, ainda é desconhecido. Porém,
corroborando com os dados já descritos na literatura, podemos dizer que a sua presença pode levar a uma determinação da conformação estrutural da proteína; assim como também atuar na ligação e interação entre as proteínas da seda ao influenciar as propriedades físico-químicas da fibra.
A glicosilação é também uma das PTMs mais comuns em certas proteínas secretadas de eucariotos contribuindo para atividades biológicas, solubilidade, estabilidade, interação célula-célula e resistência às proteases (Steinberg et al., 2001). Estudos relatam evidências de glicosilação na proteína fibrohexamerina da seda de Bombix mori (Chen et al., 2010); e também
há evidências de proteínas glicosiladas presentes no revestimento viscoso da seda da teia das aranhas Argiope aurantia, Argiope trifasciata e Araneus diadematus (Tillinghast, 1981; Vollrath
et al., 1990; Vollrath et al., 1991). Análises de microscopia de luz e microscopia eletrônica de varredura (SEM) usando lectinas também mostraram evidências de glicosilação em proteínas da seda da aranha N. clavipes (Augsten et al., 2000). No presente estudo foram observados
dois sítios de N-glicosilação N44 e N237 na sequência da espidroína-1 da aranha N. clavipes.
No resíduo Asn44 foi observada uma hexose que acrescenta um valor de 162 unidades de massa (Da); e no resíduo Asn237 foi observada uma HexNAc2dHex2 que acrescenta um valor de 698 unidades de massa (Da) na massa molecular da proteína. No presente estudo, o papel da glicosilação observada nas proteínas da seda da aranha N. clavipes, pode estar relacionado
com a estrutura conformacional, contribuindo para a resistência às proteases e estabilidade das proteínas.
A hidroxilação, uma PTM predominante em proteínas secretadas, também foi observada no presente estudo. Essa modificação que consiste na adição de grupos hidroxilas aos resíduos de prolina é catalisada pela prolil hidroxilase (PHD), garantindo uma estabilidade proteica (Kaelin, 2005). No presente estudo foi observada uma grande quantidade de hidroxiprolina ao longo da sequência da proteína da seda flageliforme, que constitui a seda da espiral de captura da teia da aranha N. clavipes. Essa seda é conhecida por ser altamente elástica, e a
observação de uma grande quantidade de resíduos de prolina hidroxilados pode perfeitamente caracterizar essa propriedade elástica apresesentada pelas fibras, assim como ocorre no colágeno encontrado no mexilhão Mytilus edulis (Qin et al., 1995; Qin et al., 1997). A
157
hidroxiprolina é um resíduo de aminoácido essencial presente no colágeno, e estudos indicam a presença de domínios estruturais no colágeno de M. edulis, semelhantes aos domínios
encontrados na seda. E esses domínios podem aumentar a força e extensibilidade do colágeno (Qin et al., 1995; Qin et al., 1997; Waite et al., 1998; Baoyong et al., 2010). No caso da proteína da seda flageliforme os sítios de hidroxiprolina estão localizados no motivo GPGGX, para o qual tem sido proposta a formação de estruturas espiral-β que podem atuar como “nanosprings” moleculares proporcionando elasticidade às fibras (Hu et al., 2006). Estudos evidenciam que a proteína da seda flageliforme não apresenta mudança conformacional durante o processo de fiação; e a grande quantidade de resíduos de prolina distribuídas regularmente ao longo da repetição de sequência GPGGX, evita a formação de estruturas folhas-β cristalinas na fibra (Ohgo et al., 2006; Rousseau et al., 2009).
Um dos principais mecanismos para a hidroxilação pode ser a ação de hidroxilases/oxidases ou radical-hidroxila, devido à exposição ambiental da seda da teia, como por exemplo, à radiação UV. Estudos tem demonstrado que a oxidação de proteínas pode conduzir a fragmentação da cadeia polipeptídica, assim como a formação de cross-linkages
entre as proteínas (Lubec, 1996; Lubec et al., 1998; Stadtman & Levine, 2003; Stadtman, 2006). No presente estudo foram observadas algumas modificações como dihidroxilação da metionina (sulphone), oxidação da tirosina (aminotirosina), oxidação da tirosina (nitrotirosina), dihidroxilação da prolina e hidroxilação do ácido aspártico. Chen et al. (2010) também relatou a presença da hidroxilação do ácido aspártico na fibroína de cadeia leve, presente na seda do casulo de Bombyx Mori, porém a função dessa modificação permanece indefinida.
A oxidação da tirosina, por exemplo, pode favorecer a formação de cross-linkages pela
combinação dos radicais tirosina, tyr-tyr, entre duas proteínas diferentes (Pryor et al., 1993; Stadtman, 1993; Stadtman, 2006). Estudos ainda indicam que a nitraçãodo resíduo de tirosina pode estar relacionado com o mecanismo de fosforilação/desfosforilação do grupo hidroxila deste resíduo, em algumas proteínas ao inibir a fosforilação (Kong et al., 1996; Stadtman & Levine, 2003), modificação já discutida anteriormente. A relevância funcional da aminotirosina e nitrotirosina observadas nas espidroínas do presente estudo permanece indefinida, porém estudos sobre as consequências biológicas de proteínas nitradas revelaram efeitos da oxidação da tirosina sobre as propriedades mecânico-elásticas, catabolismo (Parastatidis et al., 2008), e função das proteínas (Peluffo et al., 2007). Estudos de Bae et al. (2012) com a proteína bilin- biding presente na asa da borboleta Hebomoia glaucippe revelou a presença de nitrotirosina,
sendo proposta uma atuação dessa modificação nas propriedades mecânico-elásticas e interação proteína-proteína.
158
O resultado das análises nos hidrolisados da seda da aranha N. clavipes demonstraram
a presença de ditirosina (Figura 52). A ditirosina observada na amostra da seda pode representar um processo de oxidação, embora permaneça incerto se a oxidação foi introduzida por peroxidases em algum momento durante a produção/armazenamento das espidroínas na glândula; ou após a formação e liberação das fibras e exposição à radiação UV (Pouchkina et al., 2003).
Figura 52. Análises de ditirosina. Linha (a) - padrão de ditirosina, Linha (b) - hidrolisado da amostra da seda da aranha N. clavipes. Procedimento realizado: Primeira dimensão - coluna
Purospher Star RP18, 5 µm, 250 x 4 mm; eluente A - 0.1% de HCOOH + NH3, pH 3.0, eluente B - metanol, gradiente linear de 0 a 20 min, compreendido entre 95% A + 5% de B até 75% de A + 25% de B; fluxo de 0.8 mL/min, volume de injecção de 40 µL; intervalo de troca 7.7-9.1 min, tempo de retenção da ditirosina 8.4 min. Segunda dimensão - “coluna Nucleosil strong acid cation exchanger SA”, 125 x 4 mm, 10 µm tamanho de partícula; eluente A - 0.1% de HCOOH, eluente B - 0.1 M de HCOOH + NH3, pH 3.7; A + B = 60+40 (v/v), fluxo 1.0 mL/min, 285/410 nm.
As sequências das espidroínas apresentam cerca de 3% de resíduos de tirosina (Dicko et al., 2004); e foi sugerido que esses resíduos podem atuar na formação de ligações cruzadas covalentes de ditirosina, para fortificar as fibras da seda. Quando a atividade de peroxidases foi detectada na glândula ampulada maior das aranhas do gênero Nephila, como já foi discutido
anteriormente neste texto, foi proposto que a atividade das peroxidases poderia catalisar a formação de ligações cruzadas de ditirosina, e dessa forma ajudar na estabilização das
159
proteínas das fibras da seda. No entanto, até então essa formação nas fibras da seda não tem sido relatado, permanecendo por ser elucidada (Vollrath e Knight, 1999; Pouchkina et al., 2003).