Na pesquisa proteômica é muito importante obter uma melhor compreensão sobre a estrutura e função das proteínas. Uma das principais abordagens proteômicas envolve as análises de proteínas e peptídeos baseadas na espectrometria de massas (MS) com a finalidade de solucionar sequências de aminoácidos, estruturas proteicas, assim como também a identificação e localização de PTMs. Sendo assim, a espectrometria de massas emerge como uma tecnologia indispensável para a interpretação da informação codificada pelos genes, ou seja, o proteoma. Uma das forças que impulsiona a proteômica é a habilidade de usar dados de
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espectrometria de massas inerentes a peptídeos para identificar proteínas em bancos de dados.
A espectrometria de massas não é uma técnica recente, ela teve seu início em 1886 com a descoberta do íon positivo por Goldstein. O primeiro espectro de massas foi obtido por Thomson, em 1912, e o primeiro espectrômetro foi desenvolvido por Dempster em 1918, a partir desta data vários tipos de espectrômetros foram desenvolvidos, mas o grande avanço da espectrometria de massas no campo biológico ocorreu a partir da década de 80 com o desenvolvimento das técnicas MALDI (matrix-assisted laser desorption ionization) e ESI
(electrospray ionization) por Hillenkamp e Fenn respectivamente (Karas et al., 1988; Fenn et al.,
1989; Johnstone, et al., 1996). O advento de MALDI e ESI, assim como o avanço nos equipamentos em termos de sensibilidade e resolução, têm permitido que a verdadeira complexidade das amostras biológicas possa ser estudada e desvendada. Portanto, ocorreu um avanço paralelo entre as ciências “omicas” e os equipamentos/técnicas.
As análises de MS são realizadas através da integração de três componentes instrumentais: (i) uma fonte de íons, que gera íons na fase gasosa; (ii) um analisador de massas, que separa os íons na fase gasosa através da sua relação m/z; e (iii) um detector de
íons, que registra os valores de m/z de cada íon (Vestal, 2011; Lothrop et al., 2013). A
espectrometria de massas é incomparável como uma ferramenta bioanalítica - permitindo ser possível medir a massa de qualquer molécula com uma exatidão extraordinária, resolução, sensibilidade, velocidade e reprodutibilidade (Watson et al., 2007; Thelen et al., 2012); além de possibilitar a fragmentação dos íons através da espectrometria de massas in tandem, ou
também chamada de MS/MS. Sendo assim, a espectrometria de massas sequencial (MS/MS) de proteínas e peptídeos envolve a fragmentação dessas moléculas e a posterior análise de suas sequências de aminoácidos, fornecendo dessa forma informações importantes sobre a sequência e as possíveis modificações das proteínas através dos fragmentos peptídicos gerados (Breuker et al., 2008; Han et al., 2008; Tipton et al., 2011).
As análises de MS/MS desempenham um papel particularmente importante na identificação e localização de PTMs. Os mecanismos de fragmentação peptídica, comumente utilizados para as análises de PTMs, incluem a dissociação induzida por colisão (CID) (Wells et al., 2005), a dissociação por captura de elétrons (ECD) (Meng et al., 2005), e a dissociação por transferência de elétrons (ETD) (Udeshi et al., 2007; Wiesner et al., 2008). Independente do mecanismo utilizado, o desafio em todos os casos é conseguir gerar uma fragmentação que seja suficiente para identificar com precisão a sequência de aminoácidos do íon precursor e localizar a PTM nessa sequência. Uma boa fragmentação possibilita que a PTM seja retida e
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sua localização pode ser facilmente mapeada, comparando-se os valores de massas de fragmentos teóricos e observados. No entanto, PTMs instáveis podem ser perdidas dificultando a localização do seu sítio específico na sequência (Palumbo et al., 2011).
O CID ainda continua a ser o método de fragmentação escolhido para a maioria das aplicações proteômicas. No entanto, o CID resulta na fragmentação preferencial das ligações com menor energia, e no caso dos peptídeos modificados, essa é muitas vezes a ligação covalente que liga a modificação com a estrutura do peptídeo. Além disso, a fragmentação pode ser afetada devido ao comprimento do peptídeo e do estado de carga do mesmo. Sendo assim, outros métodos de fragmentação MS/MS como ECD e ETD são muitas vezes necessários para melhorar a detecção de PTMs (Wiesner et al., 2008).
Figura 11. Esquema representativo da estrutura química geral de um peptídeo, apresentando as possibilidades de fragmentações que surgem em espectros de massas obtidos por análise in tandem. Os
íons formados são enumerados a partir do lado N-terminal, sendo assim, os íons são denominados por -
a, -b ou -c se a carga for mantida no lado N-terminal e, denominados por -x, -y ou -z se a carga for
mantida no lado C-terminal. O índice indica o número do resíduo de aminoácido do fragmento em questão.
O método de fragmentação por ETD predominantemente gera íons do tipo -c e -z, enquanto que o CID gera íons do tipo -b e -y (Figura 11). Devido a natureza desses fragmentos, os dados oriundos da fragmentação por ETD complementam os dados oriundos do CID. No entanto, os dois métodos são tendenciosos no que diz respeito aos valores de m/z e
aminoácidos. Por exemplo, o CID funciona melhor para peptídeos menores carregados duplamente, enquanto que o ETD funciona melhor para peptídeos com elevado estado de carga; e ainda o CID funciona melhor quando a ligação peptídica se encontra na extremidade amino-terminal de um resíduo de prolina, sendo esse local de fácil dissociação sob CID ao
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contrário do ETD. A vantagem de se alternar o uso dos dois métodos torna se interessante, uma vez que ocorre uma complementariedade dos dados gerados por ambos. Isso se torna claro, quando, por exemplo, o sítio de fosforilação está localizado próximo a um resíduo de prolina. Sendo o ETD incapaz de quebrar essa ligação, o CID pode ser utilizado para produzir íons de elevada intensidade no respectivo sítio de clivagem (Wiesner et al., 2008; Xia et al., 2011; Kim & Pandey, 2012).
Todos os aspectos das análises por MS têm sido beneficiados devido ao acoplamento direto entre o espectrômetro de massas e os instrumentos de cromatografia líquida (LC). De fato, a sensibilidade de detecção, a fragmentação MS/MS e a interpretação dos dados melhoram muitas vezes quando as proteínas e peptídeos são devidamente separados antes das análises por MS (Ewles et al., 2011). Atualmente, até mesmo os experimentos mais básicos por LC-MS/MS podem resultar na detecção e quantificação de dezenas de milhares de íons disitintos em um intervalo curto de um gradiente padrão de LC (Di Palma et al., 2012). O uso de um sistema LC-MS/MS tem se tornado o principal método para detecção e quantificação de PTMs como tem sido demonstrado em diversos estudos (Chen et al., 2010; Redeker, 2010; Britton et al., 2011; Resende et al., 2013). No entanto, a cromatografia líquida em nanoescala acoplada à espectrometria de massas tandem (NanoLC-MS/MS), também tem se tornado uma
ferramenta essencial em apliações proteômicas. A sua sensibilidade apresenta vantagens sobre a LC-MS/MS convencional ao permitir a análise de misturas complexas de peptídeos em situações limitadas de amostras, como por exemplo, as proteínas proteoliticamente digeridas oriundas da eletroforese bidimensional. Esse sistema apresenta as seguintes vantagens: (i) uma eficiente capacidade de concentrar os peptídeos antes da detecção por analises de MS, (ii) a identificação das proteínas baseia-se no sequenciamento independente dos peptídeos com uma elevada cobertura de sequências e confiabilidade nas identificações, e (iii) toda a amostra é utilizada durante a análise evitando perdas. Dessa forma, o uso do sistema NanoLC-MS/MS tem se tornado eficiente devido a sua sensibilidade e confiabilidade (Chen et al., 2010; Gaspari, 2011).