Intermediate Wet Glass Beads

Devido aos resultados obtidos no presente estudo com a identificação, sequenciamento e localização das PTMs sobre as sequências primárias das espidroínas constituintes das fibras da seda, decidiu-se realizar a caracterização da estrutura 3D das espidroínas, através da bioinformática estrutural, para se analisar a conformação das estruturas dos motivos responsáveis pelas propriedades mecânicas das fibras com a presença das PTMs. Sendo assim, as sequências das espidroínas foram submetidas a uma busca contra o banco de dados de estruturas 3D de proteínas determinadas experimentalmente (Protein Data Bank -

http://www.rcsb.org/pdb/), para a busca e seleção de moldes (templates) que fossem

compatíveis com as espidroínas; só não foi possível encontrar moldes compatíveis com a proteína da seda flageliforme. Os moldes escolhidos foram aqueles que apresentaram uma identidade elevada, não sendo inferior a 30% com as espidroínas. Os códigos PDB dos moldes escolhidos estão mostrados na metodologia nas tabelas 3 e 4. Os valores dos parâmetros de cortes mostrados, conforme metodologia descrita anteriormente demonstram que os moldes escolhidos podem ser perfeitamente utilizados para a realização da modelagem das espidroínas. A confiabilidade da modelagem molecular por homologia de proteínas está relacionada à porcentagem de identidade na qual o modelo é baseado, estabelecendo-se uma correlação entre a similaridade sequencial e estrutural das duas proteínas (Koehl, 1999; Marti- Renom et al., 2000).

As imagens das estruturas 3D dos modelos moleculares das espidroínas constituintes das fibras da seda da aranha N. clavipes foram geradas a partir do programa PyMol (Delano,

2002) e estão ilustradas na figura 53. Posteriormente, as modificações pós-traducionais de fosforilação foram inseridas nos modelos das proteínas espidroínas-1A e -1B através do programa PyMol; e todos os modelos foram submetidos à simulação de dinâmica molecular.

Pela primeira vez, na literatura, se apresenta um modelo 3D para as espidroínas constituíntes das fibras da seda de aranhas, constando das regiões N- e C-terminal e da região central repetitiva das sequências primárias dessas proteínas da seda da teia da aranha N. clavipes. Até então, somente foram descritas partes de estruturas 3D das regiões N- e C-

terminal da espidroína-1 (Askarieh et al., 2010; Hagn et al., 2010; Hagn, 2012).

Os resultados obtidos para os modelos 3D das espidroínas constituintes das fibras da seda da aranha N. clavipes corroboram com outros estudos, que indicam que as espidroínas

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produzidas pela glândula ampulada maior, espidroínas-1 e -2 apresentam uma conformação estrutural altamente orientada constituída pelas estruturas de folhas-β, 310-helicoidal, hélice-α e

estruturas aleatórias (randômicas) nas fibras sólidas da seda, após serem secretadas durante o processo de fiação (Römer et al., 2008; Lefèvre et al., 2011; Eisoldt et al., 2011).

Figura 53. Modelos moleculares das estruturas 3D das espidroínas constituintes das fibras da seda da aranha N. clavipes. A - espidroína-1A; B - espidroína-1B; C - espidroína-2.

Nos modelos obtidos no presente estudo pode-se constatar a presença de superestruturas denominadas de grampos de folhas-β. O grampo de folhas-β é caracterizado pela presença de fitas-β anti-paralelas próximas, formando um trecho de folhas-β, o qual tem sido relacionado como uma estrutura importante para a estabilidade e nos dobramentos de proteínas (Ramirez-Alvarado et al., 1997; Simpson et al., 2005; Trevino et al., 2007; Madan et al., 2014). Representa um excelente sistema modelo para estudar a relação entre a sequência

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e a estrutura secundária, permitindo uma abordagem hierárquica para um melhor entendimento sobre os fatores que influenciam o dobramento e a estabilidade de proteínas (Kiehna et al., 2003). Entre esses fatores estão as “voltas" localizadas entre as estruturas, as interações cruzadas entre as fitas, através das cadeias laterais, e a presença de regiões hidrofóbicas; assim como ocorre com a região central repetitiva das espidroínas, essa região é tipicamente necessária para a estabilidade das proteínas que apresentam grampos de folhas-β (Syud et al., 1999; Kobayashi et al., 2000; Espinosa & Gellman, 2000; Tatko & Waters, 2002; Syud et al., 2001).

O potencial eletrostático para cada modelo foi gerado a partir do programa PyMol e está demonstrado na figura 54. Quando se compara a superfície eletrostática dos modelos, pode-se verificar que a espidroína-1A apresenta uma superfície um pouco mais eletropositiva (regiões em azul) que a espidroína-1B; enquanto que a espidroína-2 apresenta uma distribuição de cargas totalmente diferente das outras duas espidroínas.

Figura 54. Potencial eletrostático para os modelos das espidroínas gerados a partir do programa PyMol. A - espidroína-1A; B - espidroína-1B; C - espidroína-2. Imagens localizadas na parte superior da imagem estão em 0º (frente) e as imagens localizadas na parte inferior sofreram uma rotação de 180º (verso).

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Avaliar a qualidade do modelo é um quesito fundamental, pois ela será proporcional à qualidade da estrutura tridimensional utilizada como molde. Por isso, deve-se avaliar o modelo, como um todo, e, por região. Diversas metodologias existem para a avaliação da qualidade de uma estrutura, seja ela determinada experimentalmente ou por modelagem por homologia. Após a escolha do melhor modelo, análises mais criteriosas e detalhadas foram efetuadas com a utilização do PROCHECK (diagrama de Ramachandran e G-factor), para verificar a qualidade do modelo construído. O programa PROCHECK foi utilizado para analisar a geometria global dos modelos através do diagrama de Ramachandran e o G-factor. Segundo Ramachandran, uma estrutura de boa qualidade deve ter 90% ou mais de seus resíduos nas regiões mais favoráveis. As áreas em branco correspondem a regiões onde existem os choques estereoquímicos na proteína. Estas regiões não permitidas estereoquimicamente valem para todos os aminoácidos, exceto a glicina (Gly) que é a única que não tem cadeia lateral e pode adotar os ângulos de torção φ e ψ em todos os quadrantes do diagrama de Ramachandran, são representadas por triângulos no gráfico. As áreas vermelhas correspondem à conformação onde não há nenhum choque estereoquímico, ou seja, são as regiões permitidas e aonde se encontram as hélices-α e folhas-β. As áreas em amarelo escuro e claro mostram regiões limitantes, porém ainda ângulos permitidos ou generosamente permitidos, respectivamente.

No presente estudo, a análise dos diagramas de Ramachandran dos modelos das espidroínas, mostrados na figura 55 e tabela 17, demonstra que mais de 90% dos resíduos de aminoácidos estão localizados sobre as regiões favoráveis do gráfico. Portanto, os modelos gerados para as espidroínas apresentam uma boa qualidade estereoquímica, levando em consideração que essas proteínas apresentam uma grande quantidade de resíduos de aminoácidos, e ainda composta em sua maior proporção por estruturas aleatórias. Os resíduos que estão na região não favorecida estão localizados em sua maior parte, na região de estruturas aleatórias e alguns poucos em região de superfície da proteína em contato com o meio (solvente), por isso não comprometem a qualidade do modelo, pois resíduos de superfície (expostos ao solvente) e em regiões de estruturas aleatórias geralmente apresentam uma maior flexibilidade de rotação do que os resíduos localizados mais internamente na proteína.

O G-factor médio dos ângulos de torção e geometria covalente representa uma medida do desvio de uma dada propriedade estereoquímica para cada resíduo de aminoácido da estrutura. O valor ideal deste fator deve ser acima de -0.5; valores no intervalo de -0.5 a -1.0 significam que existem resíduos na proteína que devem ser investigados e, valores abaixo de - 1.0 indicam que os modelos apresentam qualidade estereoquímica ruim e devem ser investigados. O G-factor global é a melhor medida da qualidade estereoquímica total de uma

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molécula, pois representa a média de todos os G-factor obtidos para cada aminoácido da estrutura. A análise do G-factor mostrou que os modelos estão dentro dos intervalos de confiança que validam a estrutura 3D; sendo assim, pode-se afirmar que os modelos apresentam uma boa qualidade quanto ao comprimento de ângulos e sua geometria. As análises utilizando o programa PROCHECK (diagrama de Ramachandran e G-factor), estão demonstradas na tabela 17.

164 Figura 55. Avaliação da qualidade das estruturas 3D dos modelos das espidroínas constituintes das fibras da seda da aranha. Diagrama de Ramachandran para as proteínas da seda da teia de N. clavipes. A - espidroína-1A; B - espidroína-1B; C - espidroína-2.

Tabela 17. Análises para os modelos moleculares das espidroínas utilizando o programa PROCHECK. Regiões do diagrama de Ramachandran φ-ϕ (%) G-factor Modelos

3D Favorecida Mais Adicionalmente Favorecida Generosamente Favorecida Favorecida Não de torção Ângulos Geometria covalente G-factor Global

Espidroína-1A 85.9 10.0 2.5 1.6 0.30 -0.49 -0.18

Espidroína-1B 87.5 7.5 4.1 0.8 -0.21 -0.56 -0.34

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Estudos relatam que as fibras da seda de aranhas são revestidas com uma camada lipídica que é aderida sobre a fibra, após a sua formação, pela aranha (Vollrath et al., 2001; Salles et al., 2006; Sponner et al., 2007). Os lipídeos que recobrem os fios das teias, principalmente os ácidos graxos, constituem um fator importante para consolidar a estratégia de captura utilizada pelas aranhas construtoras de teias aéreas como a N. clavipes (Schulz, 2001).

Assim como outras substâncias, os lipídeos encontram-se na solução viscosa a qual é secretada pela glândula agregada e aderida sobre a fibra (Vollrath & Knight, 2001; Schulz, 2001; Romer et al., 2008). E análises de lipídeos sobre essas fibras tem indicado a presença de uma grande variedade de lipídeos. Estudos realizados com o uso de analises GC-MS realizados por Salles et al. (2006) com as fibras da teia da aranha N. clavipes demonstraram a

presença de uma diversidade de ácidos graxos saturados como o ácido decanóico, ácido dodecanóico, ácido tridecanóico, ácido tetradecanóico, ácido octadecanóico e ácido icosanóico; e também de ácidos graxos insaturados como o ácido (Z)-tetradec-9-enoic. Alguns desses lipídeos também já foram relatados previamente em outros estudos sobre os lipídeos recobrindo as fibras da teia (Prouvost et al., 1999; Schulz, 2001). Nas teias de N. clavipes a composição de

lipídeos revelou que 85% dos mesmos eram compostos de uma mistura de ácido octadecanóico e ácido tridecanóico na proporção 1:1 (Salles et al., 2006). A função dessa camada de ácidos graxos sobre as fibras da seda ainda não está bem esclarecida, porém muitos dos ácidos graxos relatados podem estar envolvidos com a estrutura central da fibra, proporcionar uma superfície suave, regulação do conteúdo de água, repelindo-a da seda, e proteção da seda contra a degradação (Schulz, 2001; Salles et al., 2006). E estudos de Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) com técnica de citoquímica para detecção de lipídeos demonstraram que tanto na superfície quanto no interior das fibras se encontra uma camada de ácidos graxos (Salles, 2003).

Devido aos resultados já descritos na literatura sobre essa camada de ácidos graxos presente nas fibras da seda, e devido aos resultados obtidos no presente estudo com a identificação das proteínas da glândula agregada, a qual secreta uma solução viscosa que é depositada sobre as fibras; a determinação da sequência primária, identificação e localização de PTMs, e determinação da estrutura 3D das espidroínas, decidiu-se então investigar, através do uso de ferramentas de bioinformática estrutural, se essa camada de ácidos graxos contribui de alguma forma para a manutenção das propriedades mecânicas da seda ao entrar em contato com as espidroínas. Ou seja, se essa camada de ácidos graxos atuaria como uma camada protetora ao manter a conformação estrutural das espidroínas, e consequentemente as propriedades mecânicas das fibras da seda quando em contato com o meio ambiente.

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Sendo assim, utilizando-se a microscopia eletrônica de transmissão (MET) com técnica de citoquímica para detecção de lipídeos, foi possível observar uma intensa marcação de ácidos graxos (aparece como precipitado negro) sobre a superfície das fibras da seda da aranha N. clavipes. Esse resultado está mostrado na figura 56. Abaixo dessa espessa camada

lipídica encontra-se uma faixa menos contrastada, constituída pelas espidroínas.

Figura 56. Microscopia eletrônica de transmissão (MET) com técnica de citoquímica para detecção de lipídeos. Fibras da seda mostrando a deposição de material lipídico formando uma camada lipídica sobre a fibra (setas).

Com a confirmação da presença de ácidos graxos nas fibras da seda, e com a determinação da estrutura 3D das espidroínas, decidiu-se então utilizar a proteína espidroína-1 como modelo, para se verificar através da bioinformática estrutural, como se dá essa interação da camada de ácidos graxos com as espidroínas constituintes das fibras da seda; desta maneira, construiu-se caixas virtuais compostas por água, e compostas por ácidos octadecanóico, ácidos tridecanóico e água, conforme discutido adiante.

A metodologia de Dinâmica Molecular, atualmente aumenta a possibilidade no avanço da compreensão de processos biológicos em escala atômica e molecular, sendo possível estudar tanto as estruturas obtidas experimentalmente como aquelas obtidas por modelagem molecular. Utilizando a metodologia de dinâmica molecular para cada modelo 3D contruído para as proteínas da seda da aranha N. clavipes, diferentes sistemas (Tabela 5) foram

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estabelecidos para as proteínas espidroína-1A e -1B, com e sem as fosforilações (modificação mais abundante observada na sequência das espidroínas), com a finalidade de obter o maior número de informações diferentes sobre as estruturas 3D dessas proteínas.

Para a representação do sistema com ácidos graxos, utilizaram-se as formas mais abundantes desses ácidos que foram identificados sobre as fibras da seda da aranha N. clavipes, conforme descrito por Salles et al. (2006). As estruturas 3D dos ácidos graxos

tridecanóico (TDA) e octadecanóico (ODA) foram construídos utilizando o programa PyMol (Figura 57). A informação sobre a topologia dos ácidos graxos não estava disponível nos campos de forças utilizados neste estudo, sendo assim, para a construção desta topologia utilizamos o servidor PRODRG (http://davapc1.bioch.dundee.ac.uk/programs/prodrg/ - Schuettelkopf & Van Aalten, 2004) o qual gera parâmetros para as ligações, ângulos e cargas.

Figura 57. Estrutura 3D dos ácidos graxos (A) tridecanóico e (B) octadecanóico contruídos a partir do programa PyMol.

Para a construção das caixas para a realização da simulação da dinâmica molecular, foram utilizados os modelos 3D oriundos da modelagem molecular, as moléculas de ácidos graxos oriundas do programa PyMol e as moléculas de água padrões do GROMACS, conforme detalhado na metodologia, tabela 5. Todas as caixas foram submetidas aos parâmetros já discutidos anteriormente na metodologia. A figura 58 apresenta uma visão geral das caixas utilizadas durante a simulação da dinâmica molecular.

As simulações de dinâmica molecular foram realizadas com a finalidade de simular as condições naturais, as quais as espidroínas são expostas constituindo as fibras sólidas na construção da teia. Dessa forma foi possível verificar como se dá a interação das moléculas de água e a camada de ácidos graxos com as espidroínas, e também se a camada de ácidos graxos contribui de alguma forma para a manutenção da conformação estrutural das espidroínas na seda quando em contato com o meio ambiente.

Utilizando a metodologia de dinâmica molecular para cada modelo 3D, primeiramente realizamos a simulação de dinâmica das espidroinas em água, com e sem a fosforilação, sendo então apresentados aqui os resultados da dinâmica final de 20 ns. As imagens das estruturas

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3D dos modelos moleculares das espidroínas após essa dinâmica foram geradas a partir do programa PyMol (Delano, 2002), e estão ilustradas na figura 59.

Figura 58. Esquema representativo das caixas que foram utilizadas durante a simulação de dinâmica molecular. Espidroína-1, representada em ribbons; água, representada em sticks vermelhos; e ácidos

graxos, representados em sticks verdes. As duas figuras representam as caixas na presença de

espidroina-1, ácidos graxos e água sob dois diferentes ângulos.

Figura 59. Modelos moleculares das estruturas 3D das espidroínas constituintes das fibras da seda da aranha N. clavipes após a dinâmica molecular de 20ns em água. A - espidroína-1A; B - espidroína-1A após a dinâmica em

água; C - espidroína-1A com fosforilação, após a dinâmica em água. D - espidroína-1B; E - espidroína-1B após a dinâmica em água; F - espidroína-1B com fosforilação, após a dinâmica em água.

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Para avaliar o comportamento global das estruturas 3D das espidroínas foi utilizado a Raiz do Desvio Médio Quadrático (RMSD) que calcula os desvios entre as conformações das proteínas no decorrer da simulação de dinâmica molecular em relação a uma estrutura de referência; o Raio de Giro (Rg) para observar a compactação e expansão da estrutura 3D das proteínas; e a variação da energia (E) em relação ao tempo, tomando como referência as estruturas 3D de cada uma das proteínas após a simulação de dinâmica molecular de restrição. Nas simulações de dinâmica molecular, mesmo após a etapa prévia de equilíbrio e restrição, quando os átomos do sistema atingem uma distribuição de velocidade compatível com a temperatura, o relaxamento das estruturas ainda continua por tempos que vão além de centenas de picos segundos (ps). Para avaliar este comportamento global das estruturas foi calculado o RMSD, e esse resultado está demonstrado na figura 60.

170 Figura 60. (A) - RMSD da espidroína-1A (azul) em relação à espidroína-1A com fosforilação (vermelho). (B) - RMSD da espidroína-1B (azul) em relação à espidroína-1B com fosforilação (vermelho).

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Na figura 60 pode-se observar que as espidroínas sem a fosforilação apresentam uma maior variação em sua estrutura 3D em relação às espidroínas com a fosforilação, ou seja, podemos sugerir que a presença da fosforilação representa um fator importante na estabilidade das espidroínas. De um modo geral, o desvio estrutural no início da dinâmica e a estabilização do RMSD podem ser interpretados como variações estruturais devido à mudança de ambiente, o qual as proteínas foram submetidas, e às características particulares de cada modelo 3D.

A análise das simulações pelo Raio de Giro nos fornece informações com relação à evolução da geometria das proteínas, se estão realizando movimentos periódicos de contração e expansão ou se estão girando. Esse resultado está demonstrado na figura 61.

172 Figura 61. (A) - Gráfico do Raio de Giro para a espidroína-1A (azul) em relação à espidroína-1A com fosforilação (vermelho). (B) - Gráfico do Raio de Giro para a espidroína-1B (azul) em relação à espidroína-1B com fosforilação (vermelho).

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Na figura 61 pode-se observar que as espidroínas fosforiladas apresentam-se um pouco mais compactas em relação às espidroínas sem qualquer PTM.

Para verificar se o sistema, no qual as espidroínas foram submetidas, está estável energeticamente, realizou-se a análise das simulações por Energia construindo o gráfico da evolução da energia total do sistema em função do tempo. Na figura 62 pode-se observar que o sistema é estável durante toda a simulação de dinâmica molecular, e que a introdução dos grupos fosfato nas espidroínas elevou o nível de energia destas moléculas, em relação às moléculas sem PTMs, sem perder a estabilidade.

174 Figura 62. (A) - Gráfico do Energia total para a espidroína-1A (azul) em relação à espidroína-1A com fosforilação (vermelho). (B) - Gráfico do Energia total para a espidroína-1B (azul) em relação à espidroína-1B com fosforilação (vermelho).

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O programa PROCHECK foi utilizado para analisar a geometria global dos modelos, após a dinâmica molecular final em água, através do diagrama de Ramachandran e o G-factor. A análise dos diagramas de Ramachandran dos modelos das espidroínas, mostrados na figura 63 e tabela 18, demonstra que mais de 90% dos resíduos de aminoácidos estão localizados sobre as regiões favoráveis do gráfico. Portanto, os modelos das espidroínas apresentam uma boa qualidade estereoquímica, levando em consideração que essas proteínas apresentam uma grande quantidade de resíduos de aminoácidos, e ainda composta em sua maior proporção por estruturas aleatórias. Os resíduos que estão na região não favorecida, estão localizados em sua maior parte na região de estruturas aleatórias e alguns poucos em região de superfície da proteína em contato com o meio (solvente), por isso não comprometem a qualidade do modelo, pois resíduos de superfície (expostos ao solvente) e em regiões de estruturas aleatórias geralmente apresentam uma maior flexibilidade de rotação do que os resíduos localizados mais internamente na proteína. A análise do G-factor mostrou que os modelos estão dentro dos intervalos de confiança que validam a estrutura 3D; sendo assim, pode-se afirmar que os modelos apresentam uma boa qualidade quanto ao comprimento de ângulos e sua geometria. As análises utilizando o programa PROCHECK (diagrama de Ramachandran e G-factor), estão demonstradas na tabela 18.

Após a dinâmica molecular de 20ns em água pode-se notar que ocorre alguma perda da conformação estrutural nas espidroínas, sendo bem visível a perda da superestrutura de grampo de folhas-β (Figura 59), que apresenta uma extensa região hidrofóbica. Conforme já discutido anteriormente essa estrutura está relacionada com a estabilidade e dobramentos de proteínas (Trevino et al., 2007; Madan et al., 2014). Sendo assim, pode-se sugerir que quando as fibras estão expostas a um meio aquoso, como por exemplo, nas condições ambientais, as fibras podem perder as suas propriedades mecânicas, já que essas propriedades dependem da