A melhor forma de se realizar um estudo de análise proteômica é determinar e/ou conhecer bem a pergunta biológica do estudo que se pretende realizar. Sendo assim, podemos definir o estudo de uma análise proteômica com uma palavra-chave: estratégia. Uma estratégia experimental bem definida é necessária para que uma pergunta biológica possa ser bem resolvida. Sem contar o fato de que ao planejar uma estratégia experimental será possível otimizar o tempo gasto para a execução dos experimentos e o elevado custo dos equipamentos/técnicas e reagentes utilizados.
Atualmente são descritas três estratégias de abordagens proteômicas: bottom-up, top- down e middle-down (Meyer et al., 2011). Na abordagem bottom-up, as proteínas são
submetidas a uma digestão enzimática com uma protease, como por exemplo, tripsina, e os fragmentos peptídicos são posteriormente submetidos à análise de MS (Woods et al., 2012; Sokolowska et al., 2012). Uma desvantagem dessa abordagem é devido ao tempo para a realização de todo o processo da digestão enzimática para a obtenção dos fragmentos peptídicos antes das análises de MS. Além disso, a utilização de enzimas proteolíticas apresenta algumas limitações, como baixa termoestabilidade, possibilidade de autólise devido a valores de pH básicos e uma cobertura de sequência parcial da proteína (Baud et al., 1999; Thelen et al., 2012). Para a obtenção de uma melhor cobertura de sequência (próximo de 100%) é necessário utilizar diferentes enzimas proteolíticas além da tripsina, como por exemplo,
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quimiotripsina, pepsina, Asp-N e outras proteases (Fischer et al., 2006; Swuaney et al., 2010). Dessa forma, a abordagem bottom-up possibilita também a identificação e localização de PTMs
na sequência da proteína devido à obtenção de uma elevada cobertura da sequência. Entretanto, o aumento da complexidade introduzida por essa abordagem requer outro nível de separação, independente de um fracionamento a nível proteico previamente aplicado, antes que uma análise aprofundada possa ser realizada através da espectrometria de massas, os fragmentos peptídicos são tipicamente separados por cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa (RP-HPLC).
Já na abordagem top-down, a proteína intacta, ou seja, sem ser submetida a uma
digestão enzimática, também pode ser submetida a uma análise de MS. Trata-se de um processo rápido já que não há a necessidade de digestão enzimática para as análises de MS, no entanto, requer tanto o uso de instrumentos de alta precisão de massa, bem como a utilização de algoritmos de deconvolução (Garcia et al., 2010; Tipton et al., 2011). Essa abordagem também possibilita a obtenção de uma elevada cobertura da sequência da proteína e estudos de PTMs. Apesar de ser uma estratégia mais recente para as aplicações proteômicas, a utilização da abordagem top-down tem aumentado cada vez mais devido aos
grandes avanços na espectrometria de massas.
A combinação de ambas as abordagens tem sido considerada a melhor estratégia a ser utilizada em uma análise proteômica devido à complementação dos resultados obtidos de cada abordagem. Sendo assim, recentemente surgiu a abordagem middle-down, uma forma híbrida
oriunda das abordagens bottom-up e top-down. Nesta abordagem, as proteínas intactas e de
elevado peso molecular são submetidas a uma fragmentação limitada, dando origem aos grandes fragmentos peptídicos (3-20 kDa), os quais são sequenciados utilizando-se a abordagem top-down, mantendo dessa forma as vantagens de uma elevada porcentagem de
cobertura da sequência e retenção das informações de PTMs. (Cannon et al., 2010; Meyer et al., 2011).
Todas essas abordagens mencionadas anteriormente podem ser realizadas em associação com tecnologias sofisticadas e sensíveis de fracionamento proteíco, como a 2-DE, e cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa (RP-HPLC). A 2-DE é o método mais eficiente de separação simultânea de centenas ou milhares de proteínas, as quais são separadas com base em duas das suas propriedades: numa primeira dimensão de acordo com o seu ponto isoelétrico (pI) e, numa segunda dimensão, em gel de SDS-PAGE, de acordo com o seu peso molecular (MW). Também, em muitos casos, permite a separação de diferentes isoformas das proteínas. Porém, a faixa dinâmica é limitada e a quantificação das proteínas é
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normalmente baseada na intensidade dos spots, por meio da análise das imagens geradas
(Minden et al., 2009; Lewandowska-Gnatowska et al., 2011). A quantificação pode também ser comprometida se um spot do gel contém mais do que uma proteína, apesar da alta resolução
isso pode muitas vezes ocorrer (Roepstorff, 2012). Outra razão é a dificuldade em se estudar proteínas de membrana ou proteínas que apresentam alto/baixo peso molecular ou alto/baixo pI (Brewis et al., 2010). A estratégia frequentemente aplicada, conhecida como Gel-LC-MS/MS, consiste na separação de proteínas em 2-DE seguida de digestão das proteínas utilizando uma enzima proteolítica, extração dos fragmentos peptídicos e análise dos mesmos através de LC- MS/MS (cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas) (Wang et al., 2010).
Outra estratégia utilizada é denominada como análise proteômica de shotgun. Trata-se
de um método utilizado para a análise de uma amostra complexa de proteínas sem uma separação prévia. Para amostras contendo nenhum detergente e de baixa a média complexidade, a digestão em solução e injeção da amostra em cromatógrafo acoplado diretamente ao espectrômetro de massas pode ser a melhor escolha (Haas et al., 2006). Os diversos fragmentos peptídicos gerados são separados e já analisados, podendo então ser contrastados com os bancos de dados. Neste caso, isoformas de proteínas não são muitas vezes diferenciadas e informações referentes às PTMs podem ser perdidas, assim como também informações referentes às proteínas pouco abundantes na amostra. Isto é devido ao fato de que os espectrômetros de massas conseguem visualizar apenas a sequência de um número limitado de peptídeos num determinado “espaço de tempo”, e estes serão normalmente visualizados como os picos de maior intensidade, enquanto que os picos pouco abundantes na amostra não serão sequenciados. No entanto, é possível obter um maior número de identificações através da introdução de listas de exclusão, de modo que os picos que foram sequenciados numa primeira análise sejam excluídos em uma segunda análise (Roepstorff, 2012).