5 Analysis
5.1 The Peacebuilding Priority Plan of 2013-2016
5.1.5 The Need for Closure
anticorps ant-CD4, anti-TCR et anti-IFN-γ. La prolifération (dilution du CFSE ;
histogrammes en haut) et la production d’IFN-γ (marquage intracytoplasmique ou ICS ;
histogrammes en bas) des lymphocytes T CD4 sont analysées en cytométrie de flux (FACS).
20%
CFSE
IFN-γ
CFSE CFSE CFSE
30% 34% 31%
IFN- γ IFN- γ IFN- γ
-
CD8 High CD8 Int CD8 LowCPA allogéniques + +/- Lymphocytes T CD4 CFSE+ Sous-populations T CD8 CD45RC 41% 49% 44% 42% Marquages ICS Analyse FACS
études fonctionnelles afin d’analyser, la capacité de ces cellules régulatrices à contrôler les lymphocytes T effecteurs CD4 et CD8 et d’analyser les mécanismes de régulation. Les capacités des sous-populations T CD8 CD45RC humaines à prédire le rejet pourrait aussi s’expliquer par des capacités régulatrices des lymphocytes T CD8 CD45RCint
et CD45RClow .
Des expériences de co-culture nous permettront d’étudier la capacité des lymphocytes T CD4 et T CD8 de type CD45RClow
à inhiber la réponse proliférative et la production d’IFN-
γ des lymphocytes T CD8 et T CD4 de type CD45RChigh
dans une réaction lymphocytaire mixte. Cependant, des études préliminaires ont montré que les lymphocytes T CD4 et T CD8 CD45RClow
humains étaient incapables de contrôler des lymphocytes T CD4 effecteurs in vitro en stimulation polyclonale ou en MLR (Figure 23) contrairement à des cellules T CD4 CD25high (non montré). Les lymphocytes T CD4 et T CD8 de type CD45RChigh ont été marqués au CFSE avant mise en culture avec des nombres croissants de cellules T CD4 CD45RClow
ou T CD8 CD45RClow
provenant du même donneur et des CPA allogéniques irradiées. L’analyse de la dilution du CFSE a permis d’étudier la prolifération des sous- populations T CD8 et T CD4 CD45RChigh. L’analyse de production d’IFN-γ a été testée par
ELISA et par marquage intracytoplasmique. Dans ces conditions nous n’avons pas pu mettre en évidence une inhibition de la prolifération ni de la production d’IFN-γ par les lymphocytes
T CD8 CD45RCint
et CD45RClow
. Mais ces résultats n’excluent pas une régulation dans d’autres conditions expérimentales ainsi qu’in vivo.
Différents mécanismes de suppression sont mis en jeu par les cellules régulatrices T. Elles peuvent agir soit directement sur la cellule effectrice soit agir sur la CPA et les rendre tolérogènes (581). In vitro, les capacités inhibitrices des lymphocytes T CD8 CD45RClow de rats sont dépendantes de la présence de CPA. En effet, les T CD8 CD45RClow ne peuvent pas moduler la prolifération ou la différenciation des lymphocytes T CD4 ou des lymphocytes T CD8 stimulés en absence de CPA (anti-TCR et anti-CD28). Différents travaux ont montré que les cellules régulatrices pouvaient rendre les CPA tolérogènes. Par exemple, les cellules T CD8 CD28- régulatrices agissent directement sur les CPA (301). Elles inhibent la surexpression des molécules de co-stimulation (CD40, CD80, CD86), et augmentent l'expression de récepteurs inhibiteurs ILT-3 et ILT-4 qui contrôlent négativement la fonction co-stimulatrice de la CPA. Ces CPA ILT3high
et ILT4high
Figure 24. Les sous-populations T CD8 CD45RC inhibent l’activation des CPA allogéniques.
Les sous-populations T CD8 CD45RC sont purifiées par cytométrie de flux puis cultivés avec des CPA allogéniques. Après 24h de culture, les cellules sont marquées avec des anticorps anti-TCR, ant-CD80, anti-CD86, anti-HLA-DR et anti-ICAM-1. L’expression des marqueurs d’activation des CPA est alors analysée en cytométrie de flux. Les carrés blancs et noirs représentent deux expériences indépendantes ou les sous-populations de lymphocytes T CD8 proviennent de deux individus différents.
20 25 30 35 40 45
High Int Low
ICAM-1 30 40 50 60 40 50 60 70 80
High Int Low
CD86
High Int Low 25
30 35 40 45
High Int Low
CD80 HLA-DR % d ’expression cellulaire sur les CPA Individu 1 Individu 2 CPA allogénique + IL-2 + 24h Analyse de l’expression d’ICAM-1, CD80, CD86 et HLA-DR sur les CPA Sous-populations
stimulation des lymphocytes T CD4 naïfs ou effecteurs en présence de ces cellules dendritiques tolérogènes va rendre les lymphocytes T CD4 silencieux ou anergiques.
Dans notre étude, nous avons analysé la capacité des sous-populations T CD45RC humaines à moduler l’activation des CPA. Lorsque les T CD8 CD45RCint et CD45RClow sont incubés avec des CPA allogéniques, nous avons pu observer une diminution de l’expression de marqueurs d’activation des CPA tels que ICAM-1, CD80 et CD86 en cytométrie de flux qui n’est pas observé avec les CD45RChigh
(Figure 24). Ceci suggère que les CD8 CD45RCint et CD45RClow
possèdent la capacité d’inactiver les CPA. L’absence de régulation, in vitro, pourrait s’expliquer par le système expérimental où l’activation des lymphocytes T CD45RChigh a lieu avant que les T CD45RClow aient pu inactiver les CPA. Il serait intéressant de pré-incuber les CPA avec les lymphocytes T CD8 CD45RCint
et CD45RClow
pendant 24 h puis d’ajouter les T CD4 marqués au CFSE. Nous pourrons ainsi analyser la prolifération de ces dernières et étudier si des CPA pré-incubées avec les T CD8 CD45RCint
et CD45RClow deviennent tolérogènes. Ces résultats pourraient expliquer pourquoi les lymphocytes T CD8 CD45RCint et CD45RClow ont un rôle protecteur dans le rejet et dans la GvHD. En effet, il a été montré que les cellules tubulaires rénales augmentent leur expression d’ICAM-1, CD80 et CD86 lors du rejet (582). L’inhibition de l’augmentation de ces molécules d’activation pourrait alors empêcher l’activation des lymphocytes T alloréactifs pathogènes et protéger du rejet.
Étant donné que les lymphocytes T CD8 CD45RCint et CD45RClow humains sont les seuls à produire de l’IL-10, le rôle des cytokines immunosuppressives dans l'inhibition de l’activation des CPA n'est pas exclu. L’IL-10 pourrait avoir un effet indirect via les CPA du receveur. En effet, L’IL-10 in vitro est capable d’inhiber l’expression de diverses molécules à la surface des cellules dendritiques telles que B7.1 et B7.2 (583) ou l’expression des molécules de classe II par les monocytes (584). Il a été montré que le contrôle du développement de la GvHD ou du rejet de greffe par les cellules T régulateurs passe par la production d'IL-10 (579, 585). Les cellules T CD8 CD122, comme les Tr1, mises en évidence pour leur rôle dans le contrôle de pathologies auto-immunes, possèdent des fonctions suppressives qui requièrent la sécrétion d’IL-10 (309, 586).
L’expression de CTLA-4 par les sous-populations T CD45RC pourra aussi être analysée. Le rôle de CTLA-4 dans l'induction de tolérance a été également montré dans des modèles d'allogreffes chez la souris et le rat (62), (313). Les T CD4 CD25+ peuvent moduler les fonctions des CPA et les rendre inaptes à activer un lymphocyte T effecteur par un mécanisme dépendant de CTLA-4. L’expression de CTLA-4 par les T CD4 CD25+ induit l’expression de l’enzyme IDO par les CPA (290). La privation en tryptophane et la présence de kinurenines pro-apoptotiques (produit de dégradation du tryptophane), entraînées par IDO, inhibent l’expansion clonale et augmentent la délétion des lymphocytes T (291). Mais étant donné que l’expression de CTLA-4 est augmentée après activation des lymphocytes T, l’analyse de l’expression membranaire de CTLA-4 ne serait pas forcément informative. Il serait plus important d’analyser l’expression des différents marqueurs des CPA tolérogènes après culture avec les différentes sous-populations T CD45RC humaines. ILT-3/ILT-4 pourront être analysés en cytométrie de flux à différents temps de culture. L’expression d’IDO par les CPA pourra être analysée par PCR quantitative et le relargage de kinurenines ainsi que la quantité de tryptophane dans le milieu pourront être analysés par chromatographie en phase liquide (587).
Par ailleurs, l’équipe d’Ignacio Anegon a identifié une sous-population T CD8 CD45RClow
chez le rat dont les mécanismes suppresseurs sont dépendants de la synthèse d’IFN-γ et d’IDO (313). Dans un modèle de greffe de cœur allogénique, le traitement des rats
receveurs avec un anticorps CD40Ig induit l’acceptation indéfinie de la greffe. Les lymphocytes T CD8 sont responsables de l’induction de tolérance. Lorsque les lymphocytes T CD8 sont séparés en fonction de l’intensité d’expression du marqueur CD45RC, seule la population T CD8 CD45RClow
est capable de transférer la tolérance. L’analyse des transcrits au sein de la greffe par RT-PCR a révélé une surexpression de Foxp3, IDO, PIR-B (l’homologue d’ILT4 chez le rat), CTLA-4 et de l’IFN-γ chez les rats traités par CD40Ig par
rapport aux rats témoins. Le traitement des rats receveurs par un anticorps neutralisant l’IFN-γ
ou par du 1-méthyl tryptophane (inhibiteur pharmacologique d’IDO) se traduit par un rejet rapide de la greffe. In vitro, ces lymphocytes T CD8 CD45RClow peuvent agir directement sur les cellules endothéliales et induire l’expression d’IDO par un mécanisme dépendant de la sécrétion d’IFN-γ. L’analyse phénotypique ainsi que le profil cytokinique de la population T
CD8 CD45RClow
induite suite au traitement par CD40Ig suggère que cette population est peu différente des T CD8 CD45RClow
naïfs de rat ainsi que des T CD8 CD45RClow
IV. ÉTUDE DU CONTRÔLE GÉNÉTIQUE DES SOUS-POPULATIONS T CD45RC HUMAINES ET DE FOXP3
Une expression altérée de CD45 n’est pas forcément la conséquence de polymorphismes dans le locus de CD45 mais peu être influencée par des molécules codées par d’autres gènes impliqués dans l’épissage ou la transcription par exemple. Notre équipe a montré que la proportion des sous-populations CD45RChigh
et CD45RClow
, aussi bien au niveau des lymphocytes T CD4 que des lymphocytes T CD8, varie en fonction des souches de rats. Il a été montré que cette variabilité est intrinsèque aux cellules hématopoïétiques et qu’elle est contrôlée génétiquement par deux locci, cec1 et cec2, situés sur les chromosomes 9 et 20 respectivement (47, 48). De façon intéressante, le locus cec1 co-localise avec différents loci associés au développement de l'EAE, de l’arthrite et aux désordres immunopathologiques de type 2 induits par les sels d’or (47, 48, 588-590). Ces études démontrent que l’intervalle du locus cec1 contient un ou plusieurs gènes impliqués dans les voies de développement de maladies auto-immunes et inflammatoires. L’identification de ce ou ces gènes ouvrirait la perspective des nouveaux traitements pour les patients atteints de ces maladies. Si nos résultats chez l’homme sont compatibles avec les travaux chez le rat, et en particulier le contrôle génétique du rapport des sous-populations T CD45RC, ceci suggère que ce rapport pourrait être relié à des formes cliniques distinctes de pathologies auto-immunes et au développement du rejet ou de la GvHD.
De plus, il a été montré que le locus cec1 contrôle aussi la proportion des lymphocytes régulateurs Foxp3+ du rat (Colacios C et al. en préparation). La carte physique de cette région a permis de mettre en évidence quatre gènes. Après séquençage, un polymorphisme majeur dans le gène Vav1 a été trouvé (Colacios C et al. en préparation). Cette mutation entraîne la substitution d’une arginine en tryptophane dans le domaine CH de la protéine VAV1 (mutation VAV1 R63W), ce qui conduit à une diminution de 75% du taux protéique de VAV1 et à une diminution du flux calcique dans les lymphocytes T chez le rat BN qui possède le variant VAV1 W63 (Casemayou et al. en préparation). À l’aide de lignées congéniques LEW.BN pour ce locus, la mutation VAV1 W63 a été associée à la résistance à l’EAE et à une augmentation du nombre de Treg Foxp3+ (Colacios C et al. en préparation).
Chez l’Homme, nous avons montré chez plus de 608 individus que la proportion des sous-populations lymphocytaires T CD45RC dans le sang périphérique est très variable d’un individu à un autre. Nous avons montré que la distribution des proportions de CD45RC dans la population étudiée suit une loi normale avec une faible représentation des individus possédant de très forte proportion de CD45RChigh ou CD45RClow. Nous avons également montré que ces proportions sont stables au cours du temps et que même si l’âge semble légèrement influencer ces sous-populations, il n’explique pas cette grande hétérogénéité. Afin d’effectuer une étude d’association entre la proportion de ces populations lymphocytaires et les polymorphismes de la région orthologue humaine, nous avons collectionné 480 échantillons de sang humains d’individus sains pour lesquels la proportion de lymphocytes T CD45RChigh et de lymphocytes Treg Foxp3+ a été préalablement déterminé. Nous avons donc conçu des amorces de 86 SNP situés dans la région orthologue au locus cec1 que nous étudierons à l’aide de la technique ILLUMINA. Cette région contient 7 gènes : Vav1, C3,
Tnfs9, Tnfs14, CD70, TRIP10, GPR108. Nous nous sommes aussi intéressés aux polymorphismes de CD45 et de Foxp3. Afin de voir si notre population est de même origine nous avons inclus 67 AIMs (ancestry-informative markers). Par la suite, nous avons prévu de collecter des cellules de patients atteints de pathologies auto-immunes ainsi que de patients transplantés rénaux afin de déterminer si un polymorphisme dans cette région permet de prédire le développement de l’auto-immunité et le risque de rejet de greffe.
L’ensemble de ce travail de thèse montre que l'expression de la molécule CD45RC sur les lymphocytes T humains est un bon candidat pour distinguer des sous-populations ayant des propriétés auto-immunes et allogéniques différentes. CD45RC permet d’une part de définir une sous-population de lymphocytes T qui semblent impliqués dans la pathologie des vascularites à ANCA et d’autre part de prédire le rejet de greffe rénale chez l’homme et la xéno-GvHD chez la souris. L’étude plus approfondie de ces sous-populations dans les AAV pourrait permettre une meilleure compréhension de la physiopathologie de ces maladies. De plus, ces résultats ouvrent des perspectives non négligeables en transplantation. En effet, la prédiction du rejet lors de greffe d’organes solides ou de la réaction du greffon contre l’hôte lors de greffe de CSH est d’une grande importance pour pouvoir adapter les traitements immunosuppresseurs au cas par cas. Lors de greffe de CSH, la manipulation de l'équilibre de ces sous-populations T CD45RC en fonction du phénotype du donneur, pourrait aboutir à la composition d'un greffon idéal, améliorant l'efficacité de la greffe de CSH.
REFERENCES
1. Huppa, J.B., and Davis, M.M. 2003. T-cell- antigen recognition and the immunological synapse. Nat Rev Immunol 3:973-983. 2. Banchereau, J., Briere, F., Caux, C., Davoust,
J., Lebecque, S., Liu, Y.J., Pulendran, B., and Palucka, K. 2000. Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol 18:767- 811.
3. Inaba, K., Pack, M., Inaba, M., Sakuta, H., Isdell, F., and Steinman, R.M. 1997. High levels of a major histocompatibility complex II-self peptide complex on dendritic cells from the T cell areas of lymph nodes. J Exp
Med 186:665-672.
4. Guermonprez, P., Valladeau, J., Zitvogel, L., Thery, C., and Amigorena, S. 2002. Antigen presentation and T cell stimulation by dendritic cells. Annu Rev Immunol 20:621- 667.
5. Janeway, C.A., Jr. 1992. The T cell receptor as a multicomponent signalling machine: CD4/CD8 coreceptors and CD45 in T cell activation. Annu Rev Immunol 10:645-674. 6. Cella, M., Scheidegger, D., Palmer-Lehmann,
K., Lane, P., Lanzavecchia, A., and Alber, G. 1996. Ligation of CD40 on dendritic cells triggers production of high levels of interleukin-12 and enhances T cell stimulatory capacity: T-T help via APC activation. J Exp Med 184:747-752. 7. Smith-Garvin, J.E., Koretzky, G.A., and
Jordan, M.S. 2009. T cell activation. Annu
Rev Immunol 27:591-619.
8. Valitutti, S.a.E., N. 2006. Immunological Synapse. Encyclopedia of life science. 9. Feske, S. 2007. Calcium signalling in
lymphocyte activation and disease. Nat Rev
Immunol 7:690-702.
10. Hayashi, K., and Altman, A. 2007. Protein kinase C theta (PKCtheta): a key player in T cell life and death. Pharmacol Res 55:537- 544.
11. Schulze-Luehrmann, J., and Ghosh, S. 2006. Antigen-receptor signaling to nuclear factor kappa B. Immunity 25:701-715.
12. Dong, C., Davis, R.J., and Flavell, R.A. 2002. MAP kinases in the immune response.
Annu Rev Immunol 20:55-72.
13. Roose, J.P., Mollenauer, M., Ho, M., Kurosaki, T., and Weiss, A. 2007. Unusual interplay of two types of Ras activators,
differentiation and activation. Nat Rev
Immunol 3:317-330.
15. Schaeffer, E.M., Yap, G.S., Lewis, C.M., Czar, M.J., McVicar, D.W., Cheever, A.W., Sher, A., and Schwartzberg, P.L. 2001. Mutation of Tec family kinases alters T helper cell differentiation. Nat Immunol 2:1183-1188.
16. Wohlfert, E.A., and Clark, R.B. 2007. 'Vive la Resistance!'--the PI3K-Akt pathway can determine target sensitivity to regulatory T cell suppression. Trends Immunol 28:154- 160.
17. Schwartz, R.H. 1990. A cell culture model for T lymphocyte clonal anergy. Science 248:1349-1356.
18. Sharpe, A.H., and Freeman, G.J. 2002. The B7-CD28 superfamily. Nat Rev Immunol 2:116-126.
19. Rudd, C.E., and Schneider, H. 2003. Unifying concepts in CD28, ICOS and CTLA4 co-receptor signalling. Nat Rev
Immunol 3:544-556.
20. Acuto, O., and Michel, F. 2003. CD28- mediated co-stimulation: a quantitative support for TCR signalling. Nat Rev Immunol 3:939-951.
21. Swallow, M.M., Wallin, J.J., and Sha, W.C. 1999. B7h, a novel costimulatory homolog of B7.1 and B7.2, is induced by TNFalpha.
Immunity 11:423-432.
22. Hermiston, M.L., Zikherman, J., and Zhu, J.W. 2009. CD45, CD148, and Lyp/Pep: critical phosphatases regulating Src family kinase signaling networks in immune cells.
Immunol Rev 228:288-311.
23. Hutloff, A., Dittrich, A.M., Beier, K.C., Eljaschewitsch, B., Kraft, R.,
Anagnostopoulos, I., and Kroczek, R.A. 1999. ICOS is an inducible T-cell co- stimulator structurally and functionally related to CD28. Nature 397:263-266. 24. Hermiston, M.L., Xu, Z., and Weiss, A.
2003. CD45: a critical regulator of signaling thresholds in immune cells. Annu Rev
Immunol 21:107-137.
25. Desai, D.M., Sap, J., Silvennoinen, O., Schlessinger, J., and Weiss, A. 1994. The catalytic activity of the CD45 membrane- proximal phosphatase domain is required for TCR signaling and regulation. Embo J
intramolecular and intermolecular
interactions. J Biol Chem 273:17839-17845. 27. Felberg, J., and Johnson, P. 2000. Stable
interdomain interaction within the cytoplasmic domain of CD45 increases enzyme stability. Biochem Biophys Res
Commun 271:292-298.
28. Hayami-Noumi, K., Tsuchiya, T., Moriyama, Y., and Noumi, T. 2000. Intra- and
intermolecular interactions of the catalytic domains of human CD45 protein tyrosine phosphatase. FEBS Lett 468:68-72.
29. Byth, K.F., Conroy, L.A., Howlett, S., Smith, A.J., May, J., Alexander, D.R., and Holmes, N. 1996. CD45-null transgenic mice reveal a positive regulatory role for CD45 in early thymocyte development, in the selection of CD4+CD8+ thymocytes, and B cell maturation. J Exp Med 183:1707-1718. 30. Kung, C., Pingel, J.T., Heikinheimo, M.,
Klemola, T., Varkila, K., Yoo, L.I., Vuopala, K., Poyhonen, M., Uhari, M., Rogers, M., et al. 2000. Mutations in the tyrosine
phosphatase CD45 gene in a child with severe combined immunodeficiency disease.
Nat Med 6:343-345.
31. Mee, P.J., Turner, M., Basson, M.A., Costello, P.S., Zamoyska, R., and Tybulewicz, V.L. 1999. Greatly reduced efficiency of both positive and negative selection of thymocytes in CD45 tyrosine phosphatase-deficient mice. Eur J Immunol 29:2923-2933.
32. Ashwell, J.D., and D'Oro, U. 1999. CD45 and Src-family kinases: and now for something completely different. Immunol
Today 20:412-416.
33. Burns, C.M., Sakaguchi, K., Appella, E., and Ashwell, J.D. 1994. CD45 regulation of tyrosine phosphorylation and enzyme activity of src family kinases. J Biol Chem
269:13594-13600.
34. D'Oro, U., and Ashwell, J.D. 1999. Cutting edge: the CD45 tyrosine phosphatase is an inhibitor of Lck activity in thymocytes. J
Immunol 162:1879-1883.
35. Baker, M., Gamble, J., Tooze, R., Higgins, D., Yang, F.T., O'Brien, P.C., Coleman, N., Pingel, S., Turner, M., and Alexander, D.R. 2000. Development of T-leukaemias in CD45 tyrosine phosphatase-deficient mutant lck mice. Embo J 19:4644-4654.
36. McNeill, L., Salmond, R.J., Cooper, J.C., Carret, C.K., Cassady-Cain, R.L., Roche- Molina, M., Tandon, P., Holmes, N., and Alexander, D.R. 2007. The differential regulation of Lck kinase phosphorylation sites by CD45 is critical for T cell receptor signaling responses. Immunity 27:425-437. 37. Zamoyska, R. 2007. Why is there so much
CD45 on T cells? Immunity 27:421-423. 38. Irie-Sasaki, J., Sasaki, T., Matsumoto, W.,
Opavsky, A., Cheng, M., Welstead, G., Griffiths, E., Krawczyk, C., Richardson,
C.D., Aitken, K., et al. 2001. CD45 is a JAK phosphatase and negatively regulates
cytokine receptor signalling. Nature 409:349- 354.
39. Shuai, K., and Liu, B. 2003. Regulation of JAK-STAT signalling in the immune system.
Nat Rev Immunol 3:900-911.
40. Kirchberger, S., Majdic, O., Bluml, S., Schrauf, C., Leitner, J., Gerner, C., Paster, W., Gundacker, N., Sibilia, M., and Stockl, J. 2008. The cytoplasmic tail of CD45 is released from activated phagocytes and can act as an inhibitory messenger for T cells.
Blood 112:1240-1248.
41. Rogers, P.R., Pilapil, S., Hayakawa, K., Romain, P.L., and Parker, D.C. 1992. CD45 alternative exon expression in murine and human CD4+ T cell subsets. J Immunol 148:4054-4065.
42. Tong, A., Nguyen, J., and Lynch, K.W. 2005. Differential expression of CD45 isoforms is controlled by the combined activity of basal and inducible splicing-regulatory elements in each of the variable exons. J Biol Chem 280:38297-38304.
43. Earl, L.A., and Baum, L.G. 2008. CD45 glycosylation controls T-cell life and death.
Immunol Cell Biol 86:608-615.
44. Powell, L.D., Sgroi, D., Sjoberg, E.R., Stamenkovic, I., and Varki, A. 1993. Natural ligands of the B cell adhesion molecule CD22 beta carry N-linked oligosaccharides with alpha-2,6-linked sialic acids that are required for recognition. J Biol Chem 268:7019-7027.
45. Uemura, K., Yokota, Y., Kozutsumi, Y., and Kawasaki, T. 1996. A unique CD45
glycoform recognized by the serum mannan- binding protein in immature thymocytes. J
Biol Chem 271:4581-4584.
46. Lynch, K.W., and Weiss, A. 2000. A model system for activation-induced alternative