Method # 2 Literature as data

retirada do plasma seminal.

Assim, a remoção do plasma seminal pareceu ser prejudicial à preservação do sêmen de jumentos, pois no teste hiposmótico, realizado tanto às 24 horas quanto às 48 horas de armazenamento, verificou-se efeito positivo do plasma seminal (Rota et al., 2008).

Resultado similar ao impacto do plasma seminal foi observado por Ferreira et al. (1991), quando se coletou sêmen de três jumentos, sendo a diluição ajustada para uma concentração de 25 x 106 espermatozóides∕mL. No sêmen diluído em diluidor a base de leite em pó desnatado-glicose, a motilidade total foi inferior a 10%, às 120 e 168 horas, para o sêmen não centrifugado ou centrifugado, respectivamente. O vigor foi inferior a 1 (na escala de 0 a 5) às 48 horas de armazenamento, independentemente do processamento do sêmen (com ou sem centrifugação). No sêmen diluído em lactose- gema de ovo, as motilidades total e progressiva foram inferiores a 10%, respectivamente, às 168 e 144 horas para o não centrifugado, e às 96 e 72 horas de armazenamento, para o centrifugado. No geral, observou-se que o procedimento de centrifugação, com retirada do plasma seminal, não foi benéfico à preservação espermática, sendo que o diluidor de lactose-gema de ovo preservou melhor, “in vitro”, o sêmen não centrifugado de jumentos a 5ºC.

Em um experimento conduzido por Mello et al. (2000), utilizando o sêmen coletado de cinco jumentos, diluído para uma concentração final de 50 x 106 espermatozóides∕mL e, resfriado a 5ºC, observou-se uma motilidade total acima de 10% após sete dias de armazenamento, para todos os tratamentos. Entretanto, não foram observadas diferenças na morfologia, motilidade ou vigor entre os tipos de sêmen utilizados, ou seja, apenas a fração rica ou o ejaculado total. Assim, não foram vistos benefícios da retirada do plasma seminal para a preservação “in vitro” do sêmen de jumentos. Devido ao resfriamento e armazenamento, observou-se um aumento gradual de defeitos morfológicos entre 6 e 9%, observados entre 72 e 144 horas após coleta sem, contudo, observarem-se diferenças na percentagem de defeitos morfológicos entre os tratamentos com ou sem plasma seminal.

De forma contrária, Serres et al. (2002) observaram benefícios na retirada do plasma seminal, em virtude das motilidades total e progressiva terem sido superiores (p<0,01) para o sêmen centrifugado. No teste hiposmótico demonstrou-se, também, melhor conservação da estrutura dos espermatozóides no sêmen centrifugado.

2.1.3. Composição Bioquímica das Membranas da Célula Espermática

O êxito no processo de resfriamento do sêmen só pode ser alcançado através de adequado processo de armazenamento. Para isso, torna-se necessário o conhecimento da composição das membranas dos espermatozóides, que apresentam diferenças específicas para cada espécie animal. Toda manipulação do sêmen, a partir da obtenção do ejaculado, produz injúrias nas células espermáticas, principalmente no que se refere à membrana plasmática (Valle e Silva Filho, 2002).

A membrana plasmática envolve toda a célula espermática, sendo constituída por dupla camada de fosfolipídeos, numa estrutura de mosaico fluido, possuindo colesterol, proteínas e carboidratos de forma integrada. Uma relação mais alta entre o colesterol e fosfolipídeos é de extrema importância para a proteção da membrana submetida a alterações de temperatura. Em equinos e suínos essa relação é baixa, tornando a célula dessas espécies sensíveis ao resfriamento (Amann e Pickett, 1987; Valle e Silva Filho, 2002).

Uma cuidadosa consideração sobre a complexidade da membrana plasmática espermática, a interação entre seus componentes e a influência da redução da temperatura, nos processos de resfriamento e congelamento, são necessários para se obter melhorias na viabilidade dos espermatozóides após seu armazenamento. Tem sido sugerido que os danos causados às membranas plasmáticas ocorrem no momento em que há reorganização das associações entre lipídeos e proteínas, durante a mudança de temperatura, que altera a função normal das membranas. Há transição da forma fluida da membrana para a forma gel, no começo da cristalização, quando as proteínas se aglomeram em regiões mais fluidas ainda existentes, permitindo a formação de micela

invertida que modifica todo o funcionamento da bicamada fosfolipídica (Parks e Graham, 1992).

A alta concentração de ácidos graxos insaturados na membrana plasmática dos espermatozóides favorece o estresse oxidativo sofrido pelas células (Aurich, 2005). Assim, os lipídeos podem sofrer desestabilização pela ação dos radicais livres, que são gerados pelas próprias células espermáticas (Ball et al., 2001).

Estudos conduzidos por Ball et al. (2001) apontam para a importância do estresse oxidativo, causado pelas espécies reativas ao oxigênio, sobre a função espermática do sêmen preservado por longos períodos. Os autores sugerem que a H2O2 seja a espécie reativa de oxigênio mais nociva aos espermatozóides, responsável pela perda da motilidade espermática.

2.1.4. Diluidores de Sêmen

Um diluidor de sêmen adequado deverá ter pressão osmótica compatível com a sobrevivência dos espermatozóides, balanço adequado de minerais, nutrientes e compostos químicos capazes de neutralizar os produtos tóxicos produzidos pelos gametas masculinos. Substâncias protetoras devem estar presentes para evitar o choque térmico, além de estabilizarem e manterem a integridade das membranas fosfolipídicas (Pickett, 1993), por serem, essas, sensíveis às mudanças de temperatura (Valle e Silva Filho, 2002).

Os diluidores possuem várias funções, tais como a de aumentar o volume total da amostra de sêmen, fornecer nutrientes para a produção de energia, proteger os espermatozóides contra o choque térmico, controlar as alterações de pH, manter o balanço osmótico, inibir o desenvolvimento bacteriano e prolongar a sobrevivência espermática (Pickett et al., 1975; Althouse et al., 1998).

Apesar do diluidor ideal, capaz de oferecer a longevidade máxima às células espermáticas, ainda esteja por ser formulado, grande número deles tem sido utilizado com este propósito. Em sua maioria, apresentam macromoléculas da gema de ovo e/ou do leite em sua constituição (Silva Filho et al., 1994b).

Kreider et al. (1985) verificaram que após duas horas de incubação à temperatura aproximada de 37°C, o sêmen equino fresco e não diluído apresentou motilidade espermática progressiva de 38%, enquanto que a do diluído em meio à base de leite em pó desnatado foi de 69,4%, semelhante à encontrada no sêmen recém diluído.

Em um estudo conduzido por Silva Filho et al. (1994b), utilizou-se a inseminação artificial (IA) em 117 éguas, com uma taxa de concepção, ao primeiro ciclo, e taxa de concepção/ciclo, respectivamente, de 67,74% e 64,86% para o sêmen “in natura” e de 73,26% e 73,74% para o sêmen diluído no diluidor a base de leite desnatado em pó. Como não houve diferenças (p>0,05) entre os tratamentos quanto às taxas de concepção, concluiu-se que o sêmen “in natura” continua sendo o procedimento ideal, para inseminações no próprio local de obtenção do sêmen, caso realizadas no menor tempo possível após a colheita, sendo a opção de menor custo e de maior simplicidade de execução. Nenhum diluidor de sêmen desenvolvido, até aquele momento, havia conseguido melhorar as taxas de concepção obtidas com a sua utilização. No entanto, para situações adversas, o diluidor torna- se ótima opção por promover fertilidade equivalente ao sêmen a fresco não diluído.

Embora os diluidores a base de leite possuam algumas vantagens sobre os demais (baixo custo, fácil preparação, boa visualização microscópica dos espermatozóides), a necessidade de aquecimento do leite a 92–95°C, por 10 minutos, consome tempo e constitui uma possível fonte de erro (Pickett, 1993).

Segundo Batellier et al. (1997), diluidores à base de leite são amplamente conhecidos e utilizados, por sua praticidade e eficácia em proteger os espermatozóides equinos, durante o resfriamento. Entretanto, devido à complexa composição do leite, desconhecia-se os componentes benéficos, bem como aqueles capazes de causar danos às células. Para isso, foram testados oito garanhões, cujo sêmen foi submetido ao resfriamento a 4 ou 15°C, por 48 e 96 horas de armazenamento, numa concentração de 20 x 106 espermatozóides/mL. Neste experimento, observou-se que as frações que diminuíram a longevidade espermática foram o ultrafiltrado, o microfiltrado e a α-lactalbumina,

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