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enquanto que a ß-lactoglobulina e os fosfocaseinatos foram protetores. O processo de aquecimento aumentou (p<0,05) o percentual de espermatozóides móveis no sêmen diluído e resfriado a 4°C por 48 horas, sendo de 8% no leite desnatado sem tratamento térmico, e de 48% no leite desnatado aquecido. Assim, demonstrou-se que o leite cru desnatado foi impróprio para a conservação do sêmen.

Várias são as modificações na estrutura do leite, induzidas pelo tratamento térmico: o diâmetro das micelas de caseína aumenta, proteínas do soro e enzimas são parcialmente desnaturadas, grupos sulfídrilas (SH) são liberados e a concentração de minerais decresce pela adsorção de íons nas micelas de caseína. No entanto, a desnaturação enzimática parece ser a modificação mais importante no leite, explicando a diferença de sobrevivência espermática entre o leite cru e o leite UHT. Tal confirmação veio pela observação de que o aquecimento afetou somente as frações contendo proteínas solúveis (Batellier et al., 1997).

Em um estudo conduzido por Meirelles et al. (1998), avaliou-se a motilidade progressiva do sêmen resfriado a 4°C, nos tempos zero, 24 e 48 horas após diluição, que foi de 48%, 18% e 5%, respectivamente, para o leite em pó desnatado não aquecido; de 48%, 21% e 6% para o leite em pó desnatado, aquecido e inativado; de 49%, 14% e 5% para o leite UHT tipo A; de 48%, 17% e 6% para o leite UHT tipo B; e de 44%, 0% e 0% para o controle (não diluído). Observou-se, neste trabalho, que a adição de diluidores prolongou significativamente a manutenção da motilidade. Para o leite UHT, observou-se grande variabilidade entre as diferentes partidas, com respostas inconstantes. O leite tipo A permitiu uma queda significativa da motilidade às 24 horas de armazenamento (p<0,05), em relação aos demais diluidores, possivelmente pela maior quantidade de gordura provocar maior aglutinação dos espermatozóides. No experimento “in vivo”, utilizando-se o sêmen a fresco diluído dentro de uma hora pós-coleta, não se observou diferenças nas taxas de gestação/ciclo entre o sêmen diluído no diluidor de leite em pó desnatado não aquecido (68,0%) ou no mesmo diluidor, mas aquecido/inativado (72,2%). Assim, concluiu-se, nesse estudo, não haver necessidade de se aquecer o diluidor para diluir o sêmen equino, possivelmente pelo

tratamento térmico prévio sofrido pelo leite em pó, durante sua produção.

Em relação à utilização da gema de ovo, tem sido proposto seu uso em meios diluidores para sêmen equino, desde a década de 40 (Berliner, 1942).

De acordo com o trabalho de Bogart e Mayer (1950), houve um aumento do percentual de espermatozóides resistentes à diferentes desafios, quando o sêmen foi diluído em diluidor a base de gema de ovo, em comparação ao sêmen não diluído. Foi demonstrado que o fator de resistência dos espermatozóides, presente na gema de ovo, não somente preservou os gametas das drásticas mudanças de temperatura, como também os protegeu de condições adversas de ambiente como mudanças no pH, de pressão osmótica e do acúmulo de substâncias nocivas. Foulkes (1977) demonstrou em touros, utilizando marcadores radioativos, que as frações da gema de ovo foram incorporadas pelas células espermáticas, não sendo removidas mesmo após lavagens seriadas. Além disso, demonstrou-se que uma lipoproteína específica da gema de ovo, incorporada ao espermatozóide, protegeu a célula de injúrias durante a diluição e congelamento, usando-se como critério de avaliação a motilidade e a liberação de hialuronidase.

Entre as frações da gema de ovo, tem sido descrito que as lipoproteínas de baixa densidade compõem a fração efetiva na proteção espermática, durante os períodos críticos de choque térmico. Não se sabe o mecanismo exato, mas acredita-se que frações protetoras da gema de ovo previnam as perdas de fosfolipídeos que compõe a membrana, além de modularem os efeitos nocivos das baixas temperaturas (Parks e Graham, 1992).

Foote (2002) utilizaram um diluente a base de 20% de gema de ovo e não verificaram redução na motilidade espermática do sêmen suíno, por até dois dias de armazenamento, em qualquer das temperaturas utilizadas (5ºC, 15ºC ou 25ºC), apesar dos espermatozóides desta espécie serem extremamente sensíveis ao choque térmico, principalmente nas temperaturas abaixo de 15ºC. Entretanto, na temperatura de estocagem de 15ºC, a motilidade foi superior (p<0,05) em relação às demais, após 48 horas de armazenamento.

Em um estudo conduzido por Silva Filho (1994), comparou-se a fertilidade de éguas, inseminadas com sêmen diluído nos diluidores lactose-gema, glicina-gema, leite desnatado-glicose e o sêmen “in natura”, obtendo-se taxas de concepção ao primeiro ciclo (71,43%; 61,54%; 78,57% e 78,57%), concepção/ciclo (70,59%; 56,25%; 81,25% e 83,33%) e eficiência de prenhez (6,80; 5,50; 7,80 e 7,01), para os tratamentos na ordem em que foram citados, respectivamente. Apesar do pequeno número de ciclos/tratamento (16-18), não se observou diferenças (p>0,05) entre os mesmos, estando este estudo de acordo com o que tem sido observado pela literatura mundial, segundo a qual o uso de qualquer diluidor não conseguiu superar as taxas de concepção do sêmen “in natura”.

Possivelmente, as diferenças observadas entre os diluidores à base de leite ou com gema de ovo, em sua formulação, não estejam diretamente ligadas ao tipo de macromolécula utilizada, mas sim aos outros ingredientes que compõe o diluidor e às suas inter-relações. A presença de ingredientes ionizáveis (sulfato, fosfato), ou ricos em íons H+ (Tris), do glicerol, de uma relação de eletrólitos para não-eletrólitos inadequada, e concentrações insuficientes ou excessivas, associadas a uma pressão osmótica e a pH inadequados, podem ser mais importantes do que o tipo de macromolécula utilizada, notadamente quando o sêmen é utilizado sem estocagem, dentro de uma hora pós-colheita (Palhares et al., 1997).

Pickett et al. (1975) utilizaram sêmen de garanhões, diluído em diluidores com 2,4% ou 0,349% de Tris e obtiveram baixas taxas de gestação ao primeiro (52,9% e 16,7%) e ao segundo ciclo (26,7% e 12,5%), respectivamente. No mesmo experimento, sugeriram que diluidores contendo 22,8% de gema de ovo estivessem desenvolvendo resposta imunológica uterina. No entanto, de acordo com os resultados de Kakeya et al. (1991), observou-se que os constituintes básicos dos diluidores (leite desnatado ou gema de ovo) não influenciaram a resposta inespecífica uterina de forma marcante, apesar do contato do sêmen com o endométrio ter elevado o número de polimorfonucleares, de acordo com os exames citológicos realizados. Assim, houve reconhecimento de corpo estranho pelo endométrio no contato com o sêmen sem, contudo, existir resposta exacerbada para

qualquer tipo de diluidor utilizado, seja à base de leite desnatado ou de gema de ovo.

A literatura a respeito da viabilidade do sêmen de jumentos ainda é escassa, e os trabalhos sobre o assunto têm recebido pouca atenção nos últimos anos. Alguns diluidores foram utilizados para asininos, com base nos resultados para o sêmen equino (Berliner, 1942; Nishikawa, 1959). O prolongamento da motilidade e vigor espermáticos do sêmen asinino, resfriado e estocado por período de até 48 horas foi testado “in vitro”, com sucesso, por Ferreira (1993), ao utilizar diluidores à base de gema de ovo ou de leite em pó desnatado, tendo a lactose e a glicose como principais açúcares, respectivamente. Para Rota et al. (2008), quando o sêmen asinino foi diluído em três diluidores diferentes, a motilidade progressiva e o vigor espermático foram melhor preservados a 5°C, no Equitainer, quando diluído em meio à base de 2% de gema de ovo (INRA82-Y), em relação aos diluidores a base de leite desnatado (INRA96 e INRA82). A diferença entre os diluidores continuou, com o aumento do tempo de preservação, de maneira que após 72 horas, a motilidade progressiva continuou superior no meio INRA82-Y (75%), em relação aos outros diluidores (40%). Quanto ao sêmen de garanhões, estocado no Equitainer, observou-se uma melhor habilidade do INRA82- Y na manutenção do vigor, quando comparado aos outros diluidores após 24 horas de preservação, embora não houvesse diferenças na motilidade total e progressiva. Na preservação por 48 horas, a motilidade espermática do garanhão foi melhor preservada no INRA96, do que no INRA82-Y (Rota et al., 2005). Apesar das condições experimentais não terem sido equivalentes, a influência dos diluidores parece ser diferente entre garanhões e jumentos (Rota et al., 2008). Também Palmer (1984) obteve superioridade do diluidor à base de leite para diluição e preservação do sêmen equino, em comparação ao diluidor à base de gema de ovo (Baken I, segundo Nishikawa, 1959). Quando o sêmen foi resfriado a 4°C por 72 horas, observou-se 51,6% e 19,1% de motilidade, e quando foi mantido a 4°C por 6 horas, obteve-se taxas de concepção de 53% e 29% por ciclo, para os mesmos diluidores, na ordem mencionada anteriormente.

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