retirada antes da inseminação, obteve-se uma taxa de concepção de 62% (8∕13), embora apenas três crias tenham nascido. Papa et al. (1999) obtiveram um total de 66% de éguas gestantes, utilizando sêmen congelado asinino, com a mesma concentração espermática por dose inseminante utilizada por Oliveira et al. (2006).
Com exceção dos bovinos, o método de congelamento não foi amplamente difundido para outras espécies, pois os protocolos testados ainda não conseguiram promover níveis de fertilidade satisfatórios, similares aos obtidos com a monta natural ouIAcom sêmen a fresco ou resfriado. A reduzida fertilidade com o uso de sêmen congelado tem sido atribuída à alteração drástica da estrutura e função da membrana plasmática durante o resfriamento, congelamento e descongelamento (Parks e Graham, 1992).
2.1.6. Temperatura Final de Armazenamento e Tempo de Preservação do Sêmen
A temperatura e o tempo de armazenamento do sêmen têm efeito sobre as características de motilidade espermática, taxas de gestação e os processos decorrentes do envelhecimento celular. A temperatura ideal de estocagem do sêmen tem sido discutida pelos pesquisadores e dela dependem os processos relacionados às lesões espermáticas causadas pelo frio, a taxa de crescimento microbiano e o estresse oxidativo das membranas (Nunes et al., 2006).
A maioria dos estudos envolvendo o resfriamento do sêmen de asininos utilizou temperatura final de 4-5°C para armazenamento, sendo os “in vitro” (Mann et al., 1963; Kreuchauf, 1984; Ferreira et al., 1991; Ferreira, 1993; Santos, 1994; Beker, 1997; Mello et al., 2000; Cottorello et al., 2003; Rota et al., 2008) em maior número, em relação aos “in vivo” (Ferreira, 1993; Vidament et al., 2005).
No estudo de Kreuchauf (1984) foram coletados ejaculados de seis jumentos (Equus asinus africanus), sendo o sêmen diluído a uma taxa de 1:3 (sêmen:diluidor) e, resfriado em refrigerador, para uma temperatura final de 5°C. Imediatamente após a diluição, a motilidade progressiva média foi de 73%. Transcorridas duas horas após o início do resfriamento, a motilidade caiu em apenas 4%. Após 24 horas de
armazenamento, a motilidade média foi de 58%, caindo para 37% após 48 horas de estocagem. Finalmente, não se observou qualquer efeito da sazonalidade sobre características gerais do sêmen nem sobre a sensibilidade das células espermáticas ao resfriamento. Mann et al. (1963) também utilizaram a temperatura final de 5°C para a estocagem do sêmen de eqüídeos. O sêmen de dois pôneis e de dois jumentos foi preparado, numa diluição de 100 x 106 espermatozóides/mL, a uma taxa de diluição de 1:3,5 (20 mL sêmen:70 mL diluidor). Após 2, 4, 6 e 8 dias de armazenamento, a motilidade para os espermatozóides equinos foi de 60, 55, 25 e 18%, sendo para os reprodutores asininos de 80, 80, 75 e 60%, respectivamente, demonstrando, assim, manutenção de maior qualidade espermática em asininos.
Para o resfriamento do sêmen asinino a uma taxa de 0,6ºC∕minuto, Beker (1997) utilizou uma máquina computadorizada preconizada para o congelamento de embriões. Para tal, o sêmen foi embalado em sacos plásticos atóxicos e colocados em um recipiente com água, para manutenção da temperatura de geladeira a 5°C. Na concentração de 25 x 106 espermatozóides/mL não se observou efeito das diferentes concentrações de antibióticos no diluidor. Entretanto, para as concentrações de 50 e 100 x 106 espermatozóides/mL, as concentrações de 75000UI de Penicilina G Potássica e 50 mg de sulfato de estreptomicina ou ausência completa de antibióticos responderam por uma maior longevidade espermática (p<0,05), em relação às concentrações de 150000UI de Penicilina G Potássica e 100 mg de sulfato de estreptomicina. Quando transcorridas 24 horas de resfriamento a 5°C, a motilidade foi de 42,71, 40,42 e de 41,46%, para as concentrações de 25, 50 ou 100 x 106 espermatozóides/mL, na ausência de antibióticos. Na concentração intermediária de antibióticos, os valores para a motilidade progressiva foram de 27,71, 28,54 e de 34,58%, para as respectivas concentrações espermáticas, citadas anteriormente. Assim, não se observou efeito das diferentes concentrações espermáticas sobre a longevidade espermática. No entanto, quanto maior o tempo de armazenamento, maiores os danos observados na estrutura dos espermatozóides, representados pelo aumento de defeitos morfológicos até o sexto dia pós-coleta. Quanto aos exames bacteriológicos, houve tendência de maior número de colônias nas
amostras sem antibióticos, embora sem diferenças expressivas entre os tratamentos, provavelmente, devido às baixas temperaturas de armazenamento utilizadas.
Um elucidativo experimento foi realizado por Zidane et al. (1991), quando se demonstrou que o armazenamento do sêmen equino à temperatura mais alta, a 20°C por 48 horas, foi impróprio à preservação adequada do sêmen. Nesse estudo, além de fertilidade reduzida, observou-se severa endometrite em 21,43% (3/14) das fêmeas, por contaminação bacteriana. Entretanto, o resfriamento a 5°C respondeu por ótima taxa de fertilidade e minimização de possível contaminação das éguas, quando se utilizou inseminações com sêmen diluído e estocado por 24-48 horas.
Diante da realidade de que o metabolismo espermático produz substâncias que causam alteração do meio, como mudança de pH, Cottorello et al. (2003) estudaram a rediluição do sêmen durante a estocagem sobre a longevidade das células espermáticas de asinino. Para tal, foi utilizada a fração rica (três primeiros jatos) do sêmen de três jumentos da raça Pêga, diluídas em meio à base de gema de ovo até alcançar uma concentração de 100 x 106 espermatozóides/mL, posteriormente acondicionados em sacos plásticos atóxicos. Após diluição e envasamento, as amostras foram submetidas a uma taxa de resfriamento de 0,6°C/minuto, para uma temperatura final de 5°C e mantidas em geladeira doméstica. O sêmen resfriado foi submetido a três tratamentos, sendo T1 sem rediluição, T2 com rediluição nos dias um e três, para concentrações de 75 e 50 x 106 espermatozóides/mL e T3, com rediluição apenas no dia três para uma concentração final de 50 x 106 espermatozóides/mL. A longevidade do sêmen foi de sete dias, sendo os valores de motilidade progressiva (0-100%) e de vigor (0-5) de 70% e 4; >60% e 3; >35% e 2 e de 10% e 1, respectivamente, para os períodos de 24, 72, 120 e 168 horas de armazenamento. Nesse trabalho, não se observou efeito aditivo (p>0,05) da rediluição sobre a longevidade espermática do sêmen asinino resfriado, provavelmente porque à temperatura de 5°C o metabolismo espermático tenha sido reduzido. Consequentemente, tal fato poderia ocasionar menor produção de ácido lático, sendo desnecessário adicionar mais diluidor, seja para fornecer energia aos
espermatozóides ou na tentativa de manter o pH do diluidor dentro de padrões adequados à sobrevivência espermática.
Em um experimento, envolvendo diferentes temperaturas finais de estocagem, Cottorello et al. (2002) compararam as de 0, 5 e de 10°C para o resfriamento do sêmen asinino, diluído para uma concentração final de 100 x 106 espermatozóides/mL. Em relação aos diluidores com 3 ou 10% de gema de ovo, observou-se redução da atividade espermática (p<0,05) na temperatura de 10°C, às 48 e 72 horas de estocagem, em relação as outras temperaturas. Para o diluidor com 10% de gema de ovo, não se observou diferenças entre as temperaturas de armazenamento de 0 ou de 5°C. Por outro lado, no diluidor com 3% de gema de ovo, a motilidade espermática progressiva tendeu a ser melhor na temperatura de 5°C, em relação à de 0°C, embora uma diferença significativa só fosse observada às 96 horas de armazenamento. Esses resultados sugerem que uma maior quantidade de gema de ovo no diluidor aumente a capacidade de preservação, “in vitro”, das características espermáticas do sêmen de asininos à baixas temperaturas, como as de 0 e de 5°C. Em relação à morfologia espermática, não foram verificados, em nenhuma temperatura ou tempo de armazenamento, sinais de “choque pelo frio” observados, geralmente, pela presença de cauda enrolada ou de outros defeitos maiores espermáticos.
Na mesma linha de trabalho, Rota et al. (2008) observaram uma maior proteção das células espermáticas no diluidor contendo gema de ovo para o armazenamento do sêmen asinino a 5°C. Assim, após 72 horas de estocagem a motilidade progressiva manteve-se superior no sêmen diluído em diluidor contendo gema de ovo (75%), em relação aos outros diluidores à base de leite (40%).
Em um outro estudo, Serres et al. (2002) também testaram diferentes temperaturas de estocagem, utilizando-se, para isso, o sêmen de sete jumentos diluído a uma concentração de 50 x 106 espermatozóides/mL, em diluidor à base de leite desnatado (INRA82) e, posteriormente, resfriado a 20, 15 ou 4°C. Nesse estudo, não se observou diferenças na motilidade para o sêmen estocado a 4 ou 15°C, embora ambas as temperaturas tenham sido superiores à de 20°C (p<0,05),