Mechanical separation

Também realizamos a expressão das enzimas antioxidantes CAT, MnSOD e CuZnSOD para esclarecer melhor os parâmetros de geração de EO nas células experimentais. Como mostra a figura 27, não observamos diferença na expressão da CAT entre os grupos avaliados. Verificamos que houve aumento significante na expressão da enzima MnSOD durante a PS (p < 0,05) (figura 28). Não houve diferença significante na expressão da CuZnSOD (figura 29).

Figura 27. Expressão do gene da enzima antioxidante CAT em células do baço de camundongos. Expressão do gene CAT (n = 8/grupo, teste t, p > 0,05 PS vs CT). O GADPH foi usado como gene de referência. Os valores estão representados como Média ± EP.

Figura 28. Expressão do gene da enzima antioxidante MnSOD em células do baço de camundongos. Expressão do gene MnSOD (n = 8/grupo, teste t, p < 0,05 PS vs CT). O GADPH foi usado como gene de referência. Os valores estão representados como Média ± EP.

Figura 29. Expressão do gene da enzima antioxidante CuZnSOD em células do baço de camundongos. Expressão do gene CuZnSOD (n = 8/grupo, teste t, p > 0,05 PS vs CT). O GADPH foi usado como gene de referência. Os valores estão representados como Média ± EP.

5 DISCUSSÃO

O sono é um importante evento fisiológico que influencia diretamente a saúde e é relacionado com o SI no qual o Ca2+ age como um importante mensageiro. Neste trabalho, nós realizamos as medidas de mobilização do Ca2+ citosólico em células vivas com o objetivo de compreender as mudanças na sinalização do Ca2+ em células imunológicas do baço após diferentes períodos de PS.

O ciclo sono-vigília está diretamente influenciado pelos níveis de várias moléculas sinalizadoras, tais como citocinas produzidas pelas células do SI, contribuindo para uma comunicação bidirecional com o SNC (Majde e Krueger, 2005). A hipótese de que o sono contribui para a manutenção do SI têm sido discutidas por vários autores (Moldofsky, 1994; Dinges e cols., 1995; Bollinger e cols., 2009). Assim, as citocinas parecem flutuar em suas concentrações durante o ciclo sono-vigília (Irwin, 2002). O efeito do prejuízo de sono sobre o SI é frequentemente estudado em animais (ex: ratos e camundongos) usando o paradigma da PS (48 e 72h) e os resultados geralmente mostram uma redução na contagem de linfócitos (CD3+, CD4+ e CD8+) (Zager e cols., 2007; Satoh e Satoh, 2007; Bollinger e cols., 2009). Também uma infecção bacteriana no intestino de ratos pode ser observada após 5-20 dias de PS pela técnica de disco sobre água (Everson e Toth, 2000).

Neste trabalho, nós observamos uma interessante influência da PS na homeostase do Ca2+ em esplenócitos de camundongos. A PS por períodos maiores do que 48h promoveu uma significante redução da mobilização do

Ca2+ intracelular em esplenócitos após a adição do inibidor da SERCA, Thg (figura 6).

A diminuição da manutenção do Ca2+ no RE leva a um estresse celular devido ao envolvimento dinâmico do RE na síntese e processamento de proteínas, o qual pode resultar no acúmulo de proteínas malformadas (Mackiewicz e cols., 2007). Interessantemente, o rompimento na homeostasia do Ca2+ levando a um estresse no RE após a PS, poderá comprometer a maturação e ativação de células imunológicas, o que requer a síntese de citocinas e imunoglobulinas seguidas da translocação para a MP (Naidoo, 2009), e, por sua vez, é uma explicação razoável para a redução da resposta imunológica que ocorre após a PS em humanos e animais (Majde e Krueger, 2005; Everson, 1993; Irwin, 2002).

Como mencionado previamente, a liberação de Ca2+ dos estoques intracelulares induz seu influxo da MP devido à abertura dos canais CRAC. Isto pode ser observado comparando os resultados das células incubadas em tampão com e sem Ca2+ extracelular (figuras 6 e 7), mostrando que a presença de Ca2+ no meio é essencial para manter os altos níveis de Ca2+ necessários para a sinalização intracelular.

O acúmulo de Ca2+ nas organelas ocorrem principalmente pela atividade de ATPases (Ca2+ e H+) e, para organelas ácidas (lisossomos/endossomos, Golgi) pelo influxo de Ca2+ via trocador de Ca2+/H+ que é um importante contribuinte para a fusão de membranas entre endossomos e lisossomos ou para a sinalização intracelular (Christensen, 2002). Ensaios realizando o rompimento do gradiente de H+ nos lisossomos de células imunológicas

(macrófagos) em que foi usado o ionóforo Nig mostraram uma direta correlação do pH luminal da organela e a manutenção de Ca2+ (Christensen, 2002).

Considerando que organelas usadas na manutenção do Ca2+ além do RE, poderão ser afetadas pela PS, em nosso trabalho, ensaios realizados com Nig, corroboraram com os achados de Penning e cols, que observaram em organelas acídicas, rompimento do gradiente de pH pelo uso da Nig, levando à extrusão do Ca2+ destas organelas e mudanças no potencial de K+ na MP (Penning e cols., 2000).

Quando a Nig foi adicionada nos esplenócitos de camundongos sujeitos a 72h de PS, o aumento da fluorescência do Ca2+ foi menor do que dos animais CT (figura 9). Como pode ser visto, os animais privados de sono não apresentaram o padrão normal de resposta para a concentração do gradiente, indicando um possível rompimento nas flutuações do Ca2+ e H+ talvez por um estresse celular nas organelas ácidas (figura 12). López e cols (2005) sugerem que, após a depleção de estoques ácidos pelo rompimento do gradiente de H+, estes estoques são repostos por um mecanismo parcialmente dependente da atividade da SERCA. A existência de organelas que contem diferentes concentrações de Ca2+ pode ser diferentemente regulada, dependendo do estímulo celular. Por outro lado, o Ca2+ ou H+ATPases vacuolar, são essenciais para uma grande variabilidade de sinais de Ca2+ espaço-temporal que precisamente regulam uma variedade de funções celulares (López e cols., 2005).

É conhecido que o pH ácido dos lisossomos é mantido principalmente por uma H+ATPase vacuolar que bombeia H+ do citosol para o lumen da organela (Luzio e cols., 2007). Desse modo, a distribuição alterada de H+ entre

os lisossomos e o citosol encontrada nos camundongos provavelmente tem uma relação direta na resposta celular. O estresse no RE observado por Mackiewicz e cols (2007), resultando na perturbação da homeostase do Ca2+, estado redox, elevada síntese de proteínas secretórias, proteínas malformadas, privação de glicose e glicosilação alterada (Mackiewicz e cols., 2007) podem ser relacionados com as alterações observadas em nosso estudo.

A modulação da homeostase do sono e sua correlação com as funções do SI são um corrente foco de pesquisas (Zager e cols., 2007; Dimitrov e cols., 2007). Por sua vez, os modelos de PS são importantes para compreensão da interrelação entre estes sistemas. Por exemplo, o aumento de corticosterona plasmática associado com uma redução no peso do baço e na contagem de leucócitos totais e linfócitos em ratos privados de sono foram recentemente relatados (Zager e cols., 2007). Nossos dados esclarecem as mudanças celulares envolvidas, demonstrando uma redução da sinalização do Ca2+ nos esplenócitos que está relacionada a eventos como, desenvolvimento celular, proliferação e mortalidade celular que são essenciais para o funcionamento do SI.

Nossos resultados mostram uma redução na mobilização de Ca2+ do RE e lisossomos dos camundongos privados de sono, demonstrado pela menor liberação do íon sob exposição a drogas específicas como a Thg e a Nig (figura 6). Estes dados sugerem uma perda na regulação do conteúdo iônico nas células estudadas, junto com a alteração de H+ dos compartimentos acídicos (figura 12). A liberação diferencial do RE pode representar uma ação compensatória da célula promovendo um maior acúmulo do íon, como

resultado do comprometimento dos lisossomos e consequente alteração iônica citossólica.

Uma das organelas chave envolvida na homeostasia do Ca2+ é a mitocôndria. Esta organela é crucial para a captação do Ca2+ liberado dos estoques intracelulares quando a célula recebe um estímulo (Balaban, 2002; Hansson e cols., 2008; Feissner e cols., 2009). Nós verificamos o envolvimento da mitocôndria no rompimento da homeostase do Ca2+ em situações de PS, observando uma redução significante na captação deste íon do RE (figura 10), nas células dos animais privados de sono quando a Ca2+ATPase do RE foi inibida com a adição de Thg. Nós também avaliamos a fluorescência do Ca2+ intracelular antes da adição da droga e vimos que na situação experimental houve um aumento na concentração de Ca2+ mitocondrial (figura 11).

Nikonova e cols (2010) relataram que após 3 e 12h de PS em camundongos, a atividade de proteínas e enzimas do complexo IV da mitocôndria foi significantemente aumentada e a subunidade catalítica do complexo V foi significantemente aumentada somente após 12h de PS. Entretanto, níveis aumentados da proteína UCP2 após 12h de PS sugerem que, possivelmente, houve alterações na razão ATP/AMP quando a vigília foi extendida (Nikonova e cols., 2010). Após analisarmos a sequência temporal das concentrações de Ca2+ mitocondrial, nós observamos que, depois de 24h de PS houve um aumento exacerbado de Ca2+ nesta organela (figura 14) com consequente rompimento do PMM após 48h de PS (figura 15). Yang e cols (2008) verificaram que a PS paradoxal induziu a translocação da Bax para a mitocôndria, enquanto o citocromo c foi liberado desta para o citoplasma e a excitabilidade de neurônios piramidais da região CA1 cerebral de ratos foi

reduzida (Yang e cols., 2008). Estas mudanças induzidas pela PS são fortemente relacionadas à homeostase do Ca2+ e é possível também que mudanças observadas neste estudo contribuam para a disfunção mitocondrial.

A morfologia dos lisossomos (figura 12) mostra a disfunção desta organela induzida pela PS. Houve um rompimento do gradiente de pH lisossomal e disfunção ou perda da integridade mitocondrial (figura 14), que pode ser devida ao rompimento do pH intracelular e homeostase do Ca2+ que, por sua vez, comprometeram o PMM (figura 15). Se houve um aumento de Ca2+ citossólico e uma redução de Ca2+ no RE, uma alteração nos mecanismos envolvidos na sinalização do Ca2+ poderá ser esperada. A depleção dos estoques de Ca2+ intracelular evoca a entrada de Ca2+ através da MP pela indução de canais CRAC em vários tipos celulares (Hawkins e cols., 2010).

Recentemente, as proteínas ORAI1 e STIM1 foram identificadas como uma subunidade de canais CRAC e uma proteína sensora de Ca2+ no RE, respectivamente (Cai, 2007). A expressão de RNAm de ORAI1 e STIM1 foram analisadas, e como mostra a figura 17, um aumento significante na expressão da proteína STIM1 foi observado nos camundongos privados de sono por 72h, porém não houve diferença na expressão do canal ORAI1.

Hawkins e cols (2010) demonstraram um relacionamento entre EO e a proteína STIM1 que são mediados pela entrada de Ca2+. A contínua ativação do canal CRAC facilita um aumento nos níveis de Ca2+ tanto na célula em repouso, quanto após a ativação celular. Este aumento sustentado de Ca2+ aumenta a sobrecarga de Ca2+ na mitocôndria e influencia a função desta organela, a qual por longo tempo pode disparar a morte celular (Hawkins e cols., 2010).

Entre todas as diferentes funções do Ca2+ na fisiologia celular (Berridge e cols., 2003; Luzio e cols., 2007), o papel deste íon nas vias endocíticas pode ser de grande importância para a habilidade imunológica e/ou fagocitose. Dessa forma, a supressão da homeostase do Ca2+ observada nos esplenócitos de camundongos privados de sono poderá refletir a redução na resposta imunológica, porém podem ocorrer resultados mais drásticos nestas células como a desregulação do processo autofágico, o que por sua vez, leva à morte celular (Naidoo, 2009). Entretanto, nossos resultados sugerem que alterações secundárias, como mudanças na homeostase do Ca2+ e H+, podem ser fatores importantes que contribuem para danos e morte celular entre os efeitos deletérios da PS.

O trabalho mostra que pode haver uma correlação entre a PS e a perda da viabilidade celular através de mecanismos envolvidos na homeostase iônica (Ca2+ e H+), que pode ser evidenciada por uma baixa eficiência das células do SI, uma vez que a expressão de citocinas, fatores inflamatórios e sinalização celular são dependentes da homeostase do sono (Feske, 2007; Satoh e Satoh, 2007; Christensen e cols., 2002; Feske e cols., 2001; Bootman e cols., 2002).

Os dados apresentados na figura 13 mostram que durante as 12 primeiras horas de PS, houve um aumento significante na captação de Ca2+ pelos canais SOCE de membrana de animais privados de sono comparados aos animais do grupo CT. Em períodos que vão de 24 a 48h, houve uma similaridade com o grupo CT e o PS, porém, a partir de 60h de PS, ocorreu uma redução significante (p < 0,01) na captação do Ca2+. Estes achados sugerem que já nas primeiras horas de PS ocorreu a depleção dos estoques de Ca2+ promovendo uma rápida mobilização dos mecanismos de influxo de Ca2+.

Estes dados corroboram com os nossos resultados de 24h de PS (figuras 6 e 7) mostrando que não houve diferença no aumento da liberação de Ca2+ das organelas (RE e Lisossomos).

Há vários trabalhos mostrando a baixa eficiência do SI durante a PS (Benca e Quintans, 1997; Majde e Krueger, 2005; Everson e Toth, 2000; Everson, 1993; Zager e cols., 2007; Dinges e cols., 1995; Bollinger e cols., 2009; Todd e cols., 2008). A razão para esta baixa eficiência é ainda desconhecida, mas nossos dados sugerem fortemente que o comprometimento da homeostase de Ca2+ no interior das organelas celulares dispara mecanismos que, por sua vez, podem resultar na disfunção imunológica.

Uma importante correlação entre a deficiência no SI e prejuízo na sinalização celular foi observada quando diferentes grupos de camundongos privados de sono, que foram infectados com parasitas de malária no período após a PS (rebotes de sono). Nós verificamos uma clara deficiência na resposta à infecção por malária após 24h de rebote de sono (figura 16 A). Entretanto, após 48h de rebote de sono, nós observamos uma recuperação da resposta do SI (figura 16 B). Estes dados são muito interessantes, uma vez que eles mostraram o tempo necessário para a restauração da função normal do SI após a PS em camundongos sob condições experimentais.

Uma importante evidência já confirmada por diversos trabalhos na literatura é a interrelação entre o segundo mensageiro Ca2+ e a geração de espécies reativas de oxigênio, podendo acarretar em EO (Das e cols., 2008; Feissner e cols., 2009; Peng e Jou, 2010). A sinalização pelas vias do Ca2+ e também pelas vias das ERO são importantes para o metabolismo celular quando ocorrem de forma natural e controlada pela célula (Feissner e cols.,

2009). Há uma interação recíproca entre o Ca2+ e as ERO, uma vez que, um pode ativar a via de sinalização do outro (Peng e Jou, 2010). Porém, um excesso de Ca2+ intracelular pode disparar a geração de radicais livres levando a célula ao desequilíbrio, o que resultará na ativação de vias apoptóticas ou mesmo necrose celular (Mammucari e Rizzuto, 2010).

Uma vez que nós detectamos elevados níveis de Ca2+ mitocondrial com conseqüente rompimento do PMM nos esplenócitos de camundongos privados de sono, nós também buscamos verificar como poderiam estar os parâmetros de EO nestas células.

Em um primeiro momento, nós determinamos as medidas de peroxidação lipídica em tecido do baço e não observamos diferença estatística entre os grupos (figura 21), assim como após a estimulação tecidual à geração de potencial lipoperoxidativo (figura 22).

A CAT é uma das enzimas antioxidantes responsáveis pela conversão do H2O2 em água e oxigênio, peróxido este gerado pela dismutação do O2•−. O H2O2 gerado naturalmente pela célula é um importante bactericida e age também na eliminação de resíduos intracelulares (Miller e Britigan, 1997). Nós determinamos a atividade da CAT após a PS por 72h e observamos uma redução significante da atividade desta enzima no modelo experimental de PS (figura 23). Estes dados corroboram com os achados de Everson e cols (2005) que mostraram redução da atividade da CAT de 23 e 36% em fígados de ratos privados de sono por 5 e 10 dias respectivamente, usando do método de disco sobre água (Everson e cols., 2005).

Estes resultados sugerem que a PS causa um desequilíbrio nos mecanismos antioxidantes com possível aumento nos níveis de H2O2 livres que

poderão romper membranas de organelas e danificar a estrutura de proteínas e outros metabólitos. Ao fazermos a expressão de RNAm da CAT, não observamos diferenças estatísticas entre os grupos (figura 27). Isso sugere que o excesso de Ca2+ mitocondrial vazado para o citosol, possivelmente levou a célula a citotoxidade e interferiu na atividade da enzima CAT. A CAT é uma enzima que age principalmente no citosol, embora uma pequena quantia possa ser ativa no espaço intermembranas mitocondrial (Feissner e cols., 2009). A mitocôndria é considerada a organela chave na geração de O2•–, que é aumentado pela ativação da cadeia fosforilativa na produção intensa de ATP e pela consequente captação de Ca2+ (Cardoso e cols., 2010).

O excesso de Ca2+ é um dos fatores mais importantes para intensificar a atividade dos complexos I, II, III, IV e V da cadeia fosforilativa (Hajnoczky e cols., 1995). Dessa forma ocorre a intensa produção de O2•– que, quando livre e em excesso leva a cadeia fosforilativa a colapso e, conseqüente, perda do PMM (Kleszczynski e Sktadanowski, 2011), o que corrobora com nossos achados (figuras 14 e 15).

As medidas da atividade da SOD total realizadas em nosso trabalho mostraram um aumento significante após a PS. Por esse motivo, nós verificamos a atividade da MnSOD e CuZnSOD (figuras 25 e 26). O aumento significante da MnSOD observado na PS, confirmado também pela maior expressão de RNAm desta enzima (figura 28), sugere que a mitocôndria está tentando controlar o aumento na geração de O2•– livres nesta organela. Nichols (2004) mostrou em culturas de células que o excesso de Ca2+ captado pela mitocôndria constitui o passo essencial para a geração de ERO mitocondrial e, conseqüente, excitotoxicidade celular (Nichols, 2004). Nós não encontramos

diferenças na expressão da CuZnSOD (figuras 29), porém, nós observamos que a atividade dessa enzima foi aumentada no modelo de PS (p < 0,01; figura 26) sugerindo que houve vazamento de ERO para o citosol (O2•–). Estes achados levantam a hipótese de que a PS leva os esplenócitos a um desequilíbrio na sinalização celular (Ca2+, H+ e ERO) que por sua vez, pode desencadear morte celular. Como mostrado em nossos resultados, a redução da atividade da CAT e a não diferença da expressão da CuZnSOD na PS, corrobora com os achados de Hansson e cols., (2008) que mostra que o excesso de Ca2+ no citosol de células do cérebro de ratos induzido pela abertura do poro mitocondrial levou a um aumento na geração de H2O2 por abolir a capacidade endógena de destoxificação da célula pela GSH e NADPH (Hansson e cols., 2008).

Jung e cols (2011) observaram que a PS em humanos leva a um aumento no gasto energético comparado ao sono, à vigília e mesmo durante a recuperação do sono (Jung e cols., 2011). Há aumento dos níveis de adenosina em neurônios colinérgicos e córtex cerebral de camundongos, seguido do aumento nos níveis de fosforilação do piruvato e lactato e aumento da AMP quinase ativada durante a PS(Porkka-Heiskanen e Kalinchuk, 2010). Nossos resultados sugerem que a necessidade da célula manter suas funções durante a PS, requer uma grande quantidade de ATP. Dessa forma, a mitocôndria possivelmente recebe este sinal já nas primeiras horas de PS.Este sinal recebido pela mitocôndria, possivelmente ativa a liberação de Ca2+ de seus estoques com conseqüente entrada de Ca2+ extracelular através de canais de membrana (CRAC, SOCE). Sarsour e cols (2010) mostraram que culturas de células expostas à concentração de 21% de O2 tiveram maior

geração de ERO mitocondrial com subseqüente aumento na atividade da MnSOD comparadas a culturas expostas à apenas 4% de O2 (Sarsour e cols., 2010). O acúmulo de Ca2+ citossólico observado em nossos resultados (figura 13), possivelmente foi captado pela mitocôndria (figura 14), o que acelerou o seu metabolismo. A intensa atividade dos complexos da cadeia fosforilativa eleva a geração de ERO que, por sua vez, leva a um aumento na expressão e atividade da enzima antioxidade MnSOD. Foi demonstrado que a super expressão da MnSOD em culturas de fibroblastos da pele de camundongos reduz os níveis de ERO e preserva a morfologia da mitocôndria contra danos associados ao envelhecimento e, consequente capacidade proliferativa (Sarsour e cols., 2010). Estes dados sugerem que o aumento da atividade e expressão da MnSOD observados em nosso trabalho possivelmente é uma forma da mitocôndria tentar proteger a célula contra danos provocados por um

overload de Ca2+.

O aumento na sobrecarga de Ca2+ mitocondrial como resultado da excitotocixidade celular tem sido associado com a geração de O2•– induzindo a liberação de proteínas pró apoptóticas mitocondriais. Isto ocorre através do processo de fragmentação/condensação do DNA, lipídios e proteínas, assim como perda da integridade da membrana e desbalanço iônico culminando na morte celular por apoptose ou necrose (Vanlangenakker e cols., 2008; Rego e Oliveira, 2003). A partir de 48h de PS, o gasto energético possivelmente foi tão intenso, que a mitocôndria provavelmente entrou em exaustão, em consequência do aumento exacerbado de Ca2+ nesta organela, que com elevados níveis de ERO, pode ter provocado a abertura do poro de transição mitocondrial e o rompimento do PMM levando o vazamento de Ca2+, ERO e

enzimas mitocondriais (SOD, citocromo c etc). Este vazamento mitocondrial, possivelmente provocou danos nos canais de membrana (MP e organelas) e comprometeu a integridade de enzimas, proteínas e metabólitos citossólicos, assim como a integridade de organelas como os lisossomos e o RE.

Esses achados estão de acordo com a significante redução na contagem de células totais observadas no baço dos camundongos privados de sono por 72h (figura 18). A marcação com anticorpos específicos mostrou também uma redução significante na população de linfócitos B e ainda, embora não significativa, uma considerável diminuição na população de linfócitos Tc (20%) e células NK (26%) (figura 19). Uma vez que populações de células imunológicas estão baixas na PS, nós buscamos uma proximidade maior com as vias de morte celular (apoptose e necrose) em camundongos privados por 72 horas de sono em experimento realizados em citômetro. A marcação com anexina e 7AAD não mostraram diferenças entre os grupos (figura 20) tanto