O diagnóstico laboratorial definitivo é realizado utilizando-se técnicas micológicas, histopatológicas e sorológicas.
O diagnóstico micológico da histoplasmose deve ser feito utilizando o exame direto, através da visualização de leveduras de H. capsulatum em espécimes clínicos, que incluem urina, escarro, líquor, medula óssea, lavado brônquico e biópsias, por meio da utilização de técnicas de coloração fúngica específicas, como Wright, Giemsa e Grocott. No entanto, esse diagnóstico apresenta limitações, uma vez que as estruturas de H. capsulatum visualizadas ao microscópio podem ser confundidas com estruturas de outros patógenos fúngicos e parasitas, como por exemplo parasitas do gênero Leishmania. Dessa forma, é essencial a identificação do fungo pelo isolamento em cultivo (Guimarães, Nosanchuk et al., 2006).
O diagnóstico definitivo requer o isolamento de H. capsulatum em meios de cultura específicos, nos quais as amostras biológicas provenientes de pacientes com suspeita de histoplasmose devem ser cultivadas em meio de isolamento, entre eles Ágar Sabouraud, Mycosel e outros, com incubação a 25 °C durante 6 a 12 semanas. Nesta temperatura é observada a fase miceliar de H. capsulatum, na qual as colônias fúngicas são inicialmente lisas, mas se tornam filamentosas, cotonosas e de cor castanho com a idade. Microscopicamente, são observadas hifas hialinas septadas com macroconídios tuberculados medindo em torno de 8 μm a 15 μm de diâmetro, esféricos, ou em forma de microconídios piriformes variando de 2 μm a 6 μm de diâmetro (Garrison e Boyd, 1977). Contudo, esse procedimento é demorado e tem baixa sensibilidade. Além disso, dependendo do material processado para essa aplicação, alguns contaminantes podem crescer, complicando o diagnóstico (Guimarães, Nosanchuk et al., 2006).
A confirmação da identificação do fungo, após o isolamento de H. capsulatum na fase miceliar, é realizada por meio da sua conversão para a fase leveduriforme (Guimarães, Nosanchuk et al., 2006; Ferreira e Borges, 2009). A conversão é realizada utilizando meios enriquecidos como ágar sangue ou ágar infusão cérebro-coração (BHI) com cisteína incubado à 37 °C. Após a conversão, podem ser observadas colônias lisas, branco-amareladas, que ao microscópio evidenciam as leveduras, com formato ovóide e parede celular espessa. No entanto, H. capsulatum não é facilmente convertido e depende de condições específicas de nutrientes e temperatura, e ainda de características fisiológicas das cepas (Eissenberg e Goldman, 1991; Guimarães, Nosanchuk et al., 2006).
A histopatologia é outra forma segura de realizar o diagnóstico da histoplasmose. Biópsias de pele ou mucosas, pulmão, medula óssea, linfonodos, fígado e intestino demonstram a presença de granulomas epitelióides, onde células leveduriformes são vistas no interior de macrófagos. Esta técnica requer a utilização de colorações especiais para a visualização adequada do fungo, como hematoxilina-eosina (HE), Gomori-Grocott (impregnação pela prata) e Ácido Periódico de Schiff (PAS) (Wheat, 1989; Ferreira e Borges, 2009). Porém, a positividade encontrada na utilização de métodos de colorações especiais é somente de 50%. Além disso, resultados falso-positivos podem ocorrer quando outros fungos como Pneumocystis carinii ou artefatos de coloração estão presentes (Wheat, 1996).
Em função destas dificuldades, as técnicas sorológicas se demonstram fundamentais para o diagnóstico da histoplasmose. Estas técnicas são rápidas e têm especificidade e sensibilidade razoável. Vários ensaios sorológicos são utilizados para detectar anticorpos específicos contra o
fungo. A detecção de anticorpos e antígenos no soro humano fornece informações da doença atual que auxilia no prognóstico da infecção (Guimarães, Nosanchuk et al., 2006).
As técnicas sorológicas utilizadas para o diagnóstico da histoplasmose incluem a Imunodifusão e a Reação de Fixação do Complemento (Guimarães, Nosanchuk et al., 2006). Entre elas, a imunodifusão é a técnica mais utilizada para detectar a resposta sorológica para dois importantes antígenos de H. capsulatum, os antígenos H e M (Cordeiro, Coelho et al., 2011), com especificidade de 70 a 100%. A técnica de Reação de Fixação do Complemento tem uma sensibilidade de 70 a 90%, mas é menos específica que a imunodifusão (70 a 80%) (Guimarães, Nosanchuk et al., 2006). A sorologia desempenha um papel importante no diagnóstico da histoplasmose pulmonar aguda e pulmonar cavitária crônica (Kauffman, 2007; Smith e Kauffman, 2012). No entanto, estas técnicas não são úteis para pacientes imunossuprimidos, que não desenvolvem uma resposta de anticorpos (Smith e Kauffman, 2012).
Em algumas condições específicas, como no diagnóstico da histoplasmose disseminada em pacientes com AIDS, o método sorológico mais útil é a detecção de antígeno (Wheat, Connolly-Stringfield et al., 1991; Guimarães, Nosanchuk et al., 2006). Antígeno polissacarídeo de H. capsulatum tem sido detectado em 85% do soro e em 95% da urina de indivíduos infectados (Ferreira e Borges, 2009), através de radioimunoensaio (Guimarães, Nosanchuk et al., 2006).
Segundo Smith e Kauffman (2012), o mais novo desenvolvimento para ajudar os clínicos no diagnóstico da histoplasmose é a melhoria contínua na sensibilidade de ensaios imunoenzimáticos que detectam uma galactomanana, componente da parede celular de H. capsulatum. Estas modificações têm aumentado a sensibilidade nas análises de soro e urina, portanto a detecção de antígeno parece ser cada vez mais útil para o diagnóstico da histoplasmose disseminada em pacientes não portadores do HIV (Hage, Davis et al., 2010; Hage, Ribes et al., 2011).
Testes cutâneos de reatividade à histoplasmina também podem ser realizados. Este é um método que avalia, por via intradérmica, a reatividade do paciente frente à proteínas fúngicas (Edwards, Acquaviva et al., 1969). No entanto, estes testes não são recomendados para o diagnóstico, uma vez que um resultado positivo não distingue infecção passada ou atual. Além disso, um resultado negativo não afasta doença ativa. Dessa forma, os testes cutâneos são ideais para estudos epidemiológicos em áreas endêmicas da micose ou em indivíduos de regiões geográficas não-endêmicas que ocasionalmente visitaram áreas endêmicas (Guimarães, Nosanchuk et al., 2006; Ferreira e Borges, 2009).
Diante disso, a escolha de cada técnica a ser aplicada no diagnóstico depende principalmente das manifestações clínicas e de fatores do hospedeiro (Leimann, Pizzini et al., 2005). Neste contexto, métodos baseados na cultura do microrganismo são mais efetivos quando a carga fúngica é alta, como em pacientes com histoplasmose crônica ou disseminada. Dessa forma, a cultura não é uma técnica sensível na histoplasmose aguda e subaguda. Outros métodos são usados em paralelo a cultura para aumentar a possibilidade de diagnosticar uma infecção causada por H. capsulatum, ao mesmo tempo para fornecer informações que podem orientar a terapia da histoplasmose. Estes métodos incluem a detecção de antígenos e anticorpos, bem como as mais novas técnicas desenvolvidas no diagnóstico molecular, que são capazes de identificar a doença em estágios iniciais e aumentar a especificidade do diagnóstico (Guimarães, Nosanchuk et al., 2006).
Uma análise por PCR em tempo real de H. capsulatum foi relatada recentemente por Babady, Buckwalter et al. (2011). A especificidade do teste foi de 100% e a sensibilidade de 73%, quando comparado aos resultados da cultura. A maioria dos espécimes clínicos analisados era do trato respiratório. Segundo os autores, este ensaio é um método rápido para detecção do fungo a partir de isolados de cultura e diretamente de materiais clínicos.
1.7. Terapêutica
A terapêutica da histoplasmose varia de acordo com a síndrome clínica e o estado imunológico do hospedeiro (Ferreira e Borges, 2009).
Para o tratamento desta micose, os fármacos eficazes e disponíveis compõem diferentes opções terapêuticas, entre elas: a anfotericina B desoxicolato, que se destina ao tratamento de formas graves, pulmonares ou disseminadas; a anfotericina B lipossomal, para formas graves ou disseminadas, quando não for possível a administração de anfotericina B desoxicolato; itraconazol, para o tratamento de formas leves a moderadas, sendo útil também na manutenção pós-anfotericina B; voriconazol, medicamento eficaz que pode ser reservado para tratamentos de resgate; e posaconazol, também eficaz e reservado para tratamentos de resgate (Zaitz, Campbell et al., 2010).
Em casos de histoplasmose pulmonar crônica ou disseminada, recomenda-se geralmente doses aproximadas de 0,5 a 1 mg/kg/dia. Estudo realizado por Sarosi e Johnson (1992) avaliou 230 pacientes com histoplasmose pulmonar disseminada e AIDS, e relatou que a anfotericina B é a droga de escolha para a terapia inicial, e que embora existam falhas no tratamento com este antifúngico, a maioria dos pacientes que receberam pelo menos 15 mg/kg ao longo de 4 a 6
semanas responderam bem ao tratamento, seguido de uma dose de manutenção de 50 a 100 mg de anfotericina B, administrada uma ou duas vezes por semana. Além disso, este esquema terapêutico é altamente efetivo, revertendo as manifestações da infecção em 80% dos casos (Wheat, Connolly-Stringfield et al., 1990).
Segundo Smith e Kauffman (2012), a mais nova recomendação da Sociedade Americana de Doenças Infecciosas (Perfect, Dismukes et al., 2010) inclui a utilização de anfotericina B lipossomal preferencialmente à formulação desoxicolato, com base em um estudo controlado que demonstrou melhores resultados da forma lipossomal em pacientes com histoplasmose disseminada e AIDS.
Alguns estudos têm demonstrado o aumento do uso de voriconazol e posaconazol como alternativa para pacientes que não toleram a terapia com itraconazol. Não existem ensaios controlados, mas a experiência clínica demonstra que estes novos azóis são eficazes para o tratamento da histoplasmose. No entanto, ainda permanecem como agentes de segunda linha, como o fluconazol (Wheat, Freifeld et al., 2007; Freifeld, Proia et al., 2009; Smith e Kauffman, 2012).
A anfotericina B é um polieno muito usado no tratamento de micoses sistêmicas e tem ação fungicida de amplo espectro. Seu mecanismo de ação se dá pelo anel macrolídico, que apresenta característica hidrofóbica e se liga aos esteróis, principalmente ao ergosterol da membrana celular fúngica. A molécula também se liga ao colesterol da membrana plasmática humana, o que explica o potencial tóxico da anfotericina B. Com a ligação da droga ao ergosterol ocorre uma alteração na permeabilidade seletiva da célula fúngica permitindo a saída de nutrientes fundamentais para a célula como água, sais, açúcares e proteínas, causando assim uma deterioração metabólica e morte celular (Sokol-Anderson, Brajtburg et al., 1986). A toxicidade da anfotericina B está diretamente relacionada aos rins, uma vez que diminui o fluxo glomerular em até 80%, pelo fato de causar uma vasoconstricção local. Também apresenta mielotoxicidade podendo causar anemia em decorrência de uma alteração na eritropoetina por atuar diretamente na medula óssea (White, Marr et al., 1998; Barquist, Fein et al., 1999; Catalán e Montejo, 2006; Smith e Kauffman, 2012).
Por outro lado, os azólicos, como o itraconazol, são drogas com ação fungistática, amplo espectro de ação e seletividade para o citocromo P-450 da célula fúngica. O mecanismo de ação baseia-se na capacidade de inibir a síntese do ergosterol, um componente vital da membrana da célula dos fungos. A conseqüência do bloqueio da síntese do ergosterol é um aumento da permeabilidade da membrana celular, desencadeando alterações morfológicas que resultam em
necrose celular. O uso indiscriminado dessas drogas pode gerar formação de cepas multidrogas resistentes (Graybill, Montalbo et al., 1998; Cazedey, Azevedo et al., 2007).
Com o aumento das infecções fúngicas, aumenta também a necessidade de novos agentes antifúngicos. Os antifúngicos existentes no mercado possuem limitações terapêuticas, principalmente quando se leva em consideração os efeitos colaterais como a nefro e a hepatotoxicidade. Como exemplo de antifúngicos que apresentam esses efeitos tóxicos, temos a anfotericina B e o cetoconazol, entre outros. Além disto, podem desenvolver resistência (Zacchino, Yunes et al., 2003).
Espécies de Histoplasma estão entre um dos principais fungos patógenos e o tratamento eficaz requer tanto o diagnóstico precoce, para facilitar o início imediato da terapia, e agentes terapêuticos de amplo espectro com atividade contra os patógenos comuns e “emergentes”. No entanto, até o momento, os medicamentos disponíveis para o tratamento das infecções fúngicas invasivas eram limitados pelo seu espectro de atividade, o desenvolvimento de resistência e perfis de interações medicamentosas. Por isso, uma nova geração de triazóis, incluindo posaconazol, voriconazol e ravuconazol, tem sido desenvolvida. Esses agentes possuem atividade de amplo espectro e perfil farmacocinético favorável (Sabatelli, Patel et al., 2006).
Segundo Thompson e Wiederhold (2010), itraconazol, posaconazol, ravuconazol e isavuconazol têm potente atividade in vitro contra fungos dimórficos. De acordo com o estudo as concentrações inibitórias mínimas (CIMs) de isavuconazol foram inferiores aos valores de fluconazol, quando testados contra espécies de H. capsulatum. Porém, apenas itraconazol está totalmente disponível no Brasil. Além disto, casos de resistência cruzada com azóis são comuns, principalmente entre os fungos oportunistas (Maertens e Boogaerts, 2005). Falha terapêutica é relato comum na histoplasmose, mas ainda não há dados suficientes para o esclarecimento da resistência deste fungo, pois as metodologias para a determinação da CIM frente aos fármacos usuais ainda não são precisas e necessitam de adaptações e documentos que normatizem padrões (Wheat, Connolly et al., 2006).
Dessa forma, a incidência das infecções fúngicas causadas por linhagens resistentes vem aumentando e assim cresce também a urgência no desenvolvimento de terapias mais efetivas para o tratamento destas doenças. A descoberta de novos alvos exclusivos dos fungos e o entendimento dos mecanismos moleculares de resistência são etapas fundamentais neste processo (Perlin, Seto-Young et al., 1997).
De acordo com Tagliari, Toledo et al. (2012), as infecções fúngicas têm recebido atenção considerável nas duas últimas décadas, devido, principalmente, ao número crescente de indivíduos imunocomprometidos e o aumento das cepas fúngicas resistentes à drogas.
Além disso, Wheat, Connolly et al. (2006) relataram que um terço do total de pacientes avaliados em um estudo, apresentou falha terapêutica em decorrência de sensibilidade reduzida ao fluconazol. O mecanismo de resistência foi caracterizado pela redução na sensibilidade das enzimas dependentes do citocromo P-450, a 14α-desmetilase (CYP51ρ) e a 3-cetoesteróide redutase. Em vista disso, é necessário buscar melhor compreensão sobre os processos fúngicos infecciosos, com o objetivo de encontrar novos alvos para a terapia antifúngica.