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4.1. Material e métodos

4.1.1. Analitos, Padrões e Reagentes

Os padrões de referência utilizados para desenvolver o método foram a 1-(3- trifluorometilfenil)-piperazina (TFMPP) e a 1-(3-clorofenil)-piperazina (mCPP) adquiridas à Lipomed (Arlesheim, Suiça); a 1-(4-metoxifenil)-piperazina (MeOPP) adquirida à Sigma–Aldrich (Steinheim, Alemanha) e a ketamina adquirida à LGC Promochem (Barcelona, Espanha). Os padrões internos usados foram a 1-(2-clorofenil)piperazina (oCPP) adquirida à Sigma–Aldrich

Os reagentes necessários para a elaboração deste trabalho foram o metanol, acetato de etilo e acetonitrilo, todos eles de grau HPLC, adquiridos à Fisher Chemicals (Loughborough, Reino Unido); o ácido clorídrico (37%; grau pro-analysis) e o ácido acético glacial (grau HPLC) adquiridos à VWR (Lisboa, Portugal); o nitrito de sódio (97%) adquirido à Acros Organics (Geel, Bélgica); o hidróxido de amónio adquirido à J.T. Baker (Deventer, Holanda); e o hidrogenofosfato dipotássico adquirido à CAEM-LAB (Zedelgen, Bélgica).

4.1.2. Materiais

Os materiais utilizados no projeto foram:

 Sistema de purificação de água Mili-Q Advantage A10® system da Millipore (Lisboa, Portugal);

 Balança analítica Kern PLJ 510-3M (Balingen, Alemanha)  Vortex Mixer da Labnet International - modelo 230V;  Câmara frigorífica da Dagard – refrigeração a 4 ºC;  Micropipetas automáticas de 20 µL, 200 µL e 1000 µL;

 Centrífuga Heraeus Multifuge IS-R- Thermo Electron Corporation, (Osterode, Alemanha);

 Seringa de MEPS (100-250 μL) da SGE - Analytical Science – Austrália, adquiridas à ILC (Porto, Portugal).

4.1.3. Soluções

As soluções padrão stock, individuais das substâncias em estudo (piperazinas e padrão interno), foram preparadas em metanol na concentração de 1 mg/mL. Para tal, pesaram-se 10 mg de cada composto e diluíram-se em metanol, num balão volumétrico de 10 mL de capacidade. No caso da ketamina e do análogo deuterado, aquando da sua aquisição, estes já se encontravam em soluções metanólicas à concentração de 1 mg/mL e 100 µg/mL, respetivamente.

Foram elaboradas soluções de trabalho a concentrações de 100 µg/mL, 10 µg/mL, 1 µg/mL, 100 ng/mL e 10 ng/mL. Todas estas soluções foram armazenadas a 4 ºC e ao abrigo da luz.

Nitrito de sódio (NaNO2) à saturação (10 mL): A solução de NaNO2 à saturação foi preparada pipetando 10 mL de água para umcopo de precipitação. De seguida, pesou-se 8,2 g de NaNO2 (solubilidade em água 820 g/L a 20°C) num vidro de relógio e foi-se adicionando lentamente à água Milli-Q, sob agitação com uma vareta. No fim, transferiu-se a solução para um tubo de ensaio.

Ácido Clorídrico (HCl) 1 M (10 mL): Foi calculado o volume necessário de HCl (37%) para um

volume final de 10 mL. Depois, pipetou-se cerca de 9,16 mL de água Milli-Q para um tubo de ensaio e adicionou-se cerca 0,84 mL de HCl.

Tampão hidrogenofosfato (K2HPO4) 0,1 M (100 mL): Para preparar um volume final de 100

mL foram pesados 1,78 g de K2HPO4 e dissolvidos em água Milli-Q que foi adicionada até perfazer o volume final de 100 mL. A solução foi armazenada a 4 ºC até a sua utilização.

Ácido acético (CH3COOH) 1% (100 mL): Pipetou-se 1 mL de ácido acético glacial para um

balão volumétrico de 100 mL de capacidade contendo 50 mL de água Milli-Q. Adicionou-se água até completar o volume e homogeneizou-se por inversão.

Hidróxido de amónio (NH4OH) 5% (100 mL): Pipetou-se 5 mL de NH4OH para um balão volumétrico de 100 mL de capacidade contendo 50 mL de metanol. Para obter o volume final de 100 mL adicionou-se metanol até aferir o balão e homogeneizou-se a solução por inversão.

Metanol 10% (100 mL): A um balão volumétrico de capacidade 100 mL, adicionou-se 10 mL

de metanol e aferiu-se o volume com água Milli-Q. A solução foi homogeneizada por inversão.

4.2. Derivatização da amostra

Adicionou-se 200 µL de amostra de plasma a uma solução de 200 µL de NaNO2 à saturação com 150 µL de HCl 1 M num tubo de ensaio, a frio. De seguida, agitou-se num vórtex durante 1 minuto e procedeu-se à extração dos analitos com recurso à MEPS.

4.3. Condições cromatográficas

A análise experimental realizaou-se num sistema de cromatografia gasosa HP 7890A (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany) equipado com um espectrómetro de massa de triplo quadropolo 7000B (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany), com um autosampler MPS2 e um injetor PTV (Gerstel, Mülheim an der Ruhr, Germany). Usa-se uma coluna capilar (30 m x 0,25 mm diâmetro) com fenilmetilsiloxano 5% (HP-5 MS), fornecida por J & W

A rampa de temperatura começou a 120ºC durante 2 minutos, aumentando 10ºC/min até 260ºC. A temperatura final foi mantida constante durante 3 minutos. O tempo total de corrida cromatográfica foi de 19 minutos. A temperatura do injetor e do detetor foi de 250ºC e de 280ºC, respetivamente. A temperatura da fonte foi 230 ºC. O fluxo de hélio foi 0,8 mL/min. O volume de injeção foi 2 μL em modo splitless. Na célula de colisão o fluxo de hélio foi 1,5 mL/min e o fluxo de azoto de 2,5 mL/min em modo de impacto eletrónico com uma corrente de 35 μA e uma energia de 70 eV.

Os dados foram obtidos no modo MRM (multiple reaction monitoring) com auxílio do programa de software MassHunter WorkStation Acquisition rev. B.02.01 (Agilent Technologies), que permite escolher as transições que melhor identificam e caracterizam cada um dos analitos.

4.4. Matriz biológica

A matriz utilizada no presente trabalho foi plasma humano proveniente do excedente de transfusões sanguíneas que se encontravam fora do prazo do Instituto Português do Sangue e Transplantação (Centro de Coimbra). Estas amostras foram armazenadas a -21ºC até à sua utilização.

Relativamente à amostra real, esta foi obtida de doentes que se encontram internados ou em consulta externa no Departamento de Saúde Mental do Centro Hospitalar Cova da Beira (CHCB). As amostras foram armazenadas a -20ºC até à sua análise.

4.5. Procedimento de extração final

À amostra previamente derivatizada foi diluída 1:10 com a adição de 2 mL de tampão fosfato 0,1 M.

Após o acondicionamento da coluna (M1) com 250 μL de metanol (3 vezes) e 250 μL de água Milli-Q (3 vezes), procedeu-se à aspiração da amostra a uma velocidade de cerca de 10 µL.s-1 _{(10 vezes). A lavagem foi realizada pela passagem através da coluna de 250 μL de ácido} acético 1% e de 150 μL de metanol a 10%. Os analitos foram eluídos com 50 μL de uma solução de hidróxido de amónio a 5%.

Por fim o extrato obtido foi evaporado à secura sob corrente de azoto e adicionaram- se 100 µL acetato de etilo. Uma alíquota de 2 µL foi injetada no sistema cromatográfico anteriormente referido.

Por último, no fim de cada extração efetuou-se uma lavagem da fase estacionária com 250 μL de metanol (5 vezes) e 250 μL de água desionizada (5 vezes), evitando efeitos de