Neste experimento, foram utilizados 10 ejaculados de cinco varrões (2 ejaculados/macho), estando os dados referentes às características físicas e desempenho reprodutivo, correspondentes a cada fração do ejaculado, apresentados na tabela 13.
Observa-se na tabela 13 que o volume médio coletado na fração 2, correspondendo ao restante do ejaculado após a coleta dos 15 mL da fração 1, foi de 208,98 mL, indicando que o volume total dos ejaculados coletados no presente experimento, está dentro dos padrões estabelecidos entre 150 a 300 mL (Pinart et al., 1999).
De acordo com os valores apresentados, observa-se que não houve diferenças entre as frações no que diz respeito à motilidade do sêmen a fresco (p>0,05), estando os valores (74,5% para ambas as frações) dentro do estabelecido como critério mínimo para o processamento de um ejaculado, como proposto anteriormente, de 60% (Flowers, 1997; Johnson et al., 2000).
Quanto ao vigor espermático, observa-se que a fração 1 apresentou um valor médio superior (p<0,05) ao encontrado na fração 2. Contudo, os valores encontrados nas duas frações nesse experimento, são bem superiores ao valor mínimo preconizado para que um ejaculado seja utilizado (Silveira e Iais, 1999). Além disso, os mesmos autores citam que se deve desprezar ejaculados apresentando vigor espermático abaixo de três, em uma escala de 0 a 5.
Como esperado, o número de espermatozóides por mL diferiu (p<0,05) entre as duas frações coletadas. Para a fração 1, a concentração espermática média foi de 1692 x 106 de espermatozóides por mL, enquanto na fração 2 foi de 246 x 106 de espermatozóides por mL de sêmen. Obviamente, a concentração espermática encontrada na fração 2 apresentou-se abaixo do que normalmente observa-se para a fração rica do ejaculado, de 500 a 1000 x 106 de espermatozóides/mL (Garner e Hafez, 1996) ou mesmo para o ejaculado total (fração rica e pós-espermática), como demonstrado por Braga (2007), de 386,18 x 106 de espermatozóides/mL, após a realização de 27 coletas de sêmen.
Tabela 13. Características físicas do sêmen e desempenho reprodutivo dos varrões utilizados no Experimento I, de acordo com a fração do ejaculado utilizada
Parâmetros avaliados Fração do ejaculado
Fração 1 (15 mL) Fração 2 (restante)
Número de varrões 05 05
Número de ejaculados 10 10
Volume do sêmen (mL) 15,00 ± 0,0 208,98 ± 11,52
Motilidade do sêmen a fresco (%) 74,50 ± 1,17 74,50 ± 1,17 Vigor do sêmen a fresco (0 – 5) 4,70 ± 0,11a 4,30 ± 0,13b No de sptz/mL (x106) 1692,00 ± 184,95a 246,00 ± 26,54b No de sptz móveis/mL (x106) 1271,60 ± 148,88a 185,56 ± 22,81b No de sptz totais/fração (x109) 25,38 ± 2,77a 49,72 ± 4,29b No de sptz móveis/fração(x109) 19,08 ± 2,24a 37,38 ± 3,79b Volume de sêmen/dose inseminante (mL) 2,76 ± 0,42b 18,22 ± 1,97a Volume de diluidor/dose inseminante (mL) 97,24 ± 0,42a 81,78 ± 1,97b No potencial de fêmeas inseminadas 6,36 ± 0,75b 12,45 ± 1,26a
Tempo da colheita à pré-diluição (min) 3,80 ± 0,20 -
Tempo da colheita à diluição (min) 16,50 ± 0,96 16,90 ± 1,50 Tempo da colheita ao resfriamento (min) 45,50 ± 2,54a 37,40 ± 2,37b a,b Médias seguidas por letras diferentes, na mesma linha, diferem (p < 0,05)
As análises estatísticas referentes à tabela 13, estão apresentadas no anexo Ia do Experimento I (páginas 166 e 167).
Para a fração 1, Saravia et al. (2010) trabalhando com os primeiros 10 mL da fração rica, relataram uma concentração média para essa fração de 1600 x 106 de espermatozóides/mL, ou seja, um pouco inferior à encontrada nesse experimento, considerando-se os 15 primeiros mL do ejaculado. Os autores citam ainda, que os espermatozóides presentes nesses primeiros 10 mL (16 x 109 de espermatozóides) representaram 23,4% do número total médio de espermatozóides encontrados na fração rica do ejaculado, que constituiu-se de 68,4 x 109 de espermatozóides. Comparativamente, os dados encontrados nesse experimento, demonstram que a Fração 1 continha cerca de 25 x 109 de espermatozóides totais, nos primeiros 15 mL da fração rica, e não nos 10 mL iniciais, como relatado por Saravia et al. (2010). Para a fração 2, os autores consideraram apenas o restante da fração rica, diferentemente desse experimento, no qual considerou-se como fração 2 o restante do ejaculado total (restante da fração rica e
fração pós-espermática). Contudo, vale salientar que os autores relataram um valor médio de 57 x 109 de espermatozóides na fração 2, superior ao encontrado aqui de 49 x 109 de espermatozóides, embora considerando-se os diferentes volumes de sêmen utilizados entre os dois protocolos. Possivelmente, essa diferença se deu pelo valor médio de espermatozóides encontrados no ejaculado total entre os estudos, de 87 x 109 no estudo de Saravia et al. (2010) e de 75 x 109 de espermatozóides, no presente experimento. Vale ressaltar, que de acordo com os valores de concentração encontrados nesse estudo, a fração 1 (primeiros 15 mL da fração rica) representou 33,8% do total de espermatozóides presentes no ejaculado, o que demonstra a alta concentração espermática dessa fração, notadamente quando considera-se a grande diferença de volume, entre as duas frações (15 vs 208 mL).
Devido a escassez de trabalhos na literatura envolvendo a concentração espermática dessa primeira fração, torna-se difícil maiores comparações com a literatura consultada.
Pode-se observar na tabela 13, que os volumes de sêmen e diluidor necessários para a preparação de uma dose inseminante de 100 mL, contendo 3 x109 de espermatozóides móveis diferiram (P<0,05) entre as frações. Assim, para a fração 1, necessitou-se de um volume médio de apenas 2,76 mL de sêmen para a preparação de cada dose inseminante, enquanto que para a fração 2, esse volume foi de 18,22 mL de sêmen. Conseqüentemente, o volume médio de diluidor necessário para produzir uma dose inseminante de 100 mL, de cada fração, foi de 97,24 mL e 81,78 mL para as frações 1 e 2, respectivamente, podendo-se concluir que a taxa de diluição para a fração 1 foi de aproximadamente 1:35 (sêmen:diluidor), enquanto para a fração 2 variou entre 1:4 e 1:5 (sêmen:diluidor).
De acordo com Johnson et al. (2000), normalmente, a taxa de diluição do sêmen não ultrapassa uma relação de 1:10. Assim, considera-se ótima uma taxa de diluição (sêmen:diluidor) de 1:10 (Martin Rillo et al., 1994) ou entre 1:5 e 1:15 (Ruvalcaba, 1994), dependendo da concentração espermática do ejaculado. Segundo Levis (1997), a taxa de diluição ótima depende também das características físicas do diluidor utilizado, tais como pH, pressão osmótica e capacidade tamponante. Quando diluidores de longa duração, como o MR-A, são utilizados, a taxa ideal de diluição é de 1:8 a 1:15 (Ruvalcaba, 1994). Desta forma, considerando-se que nesse experimento utilizou-se também o diluidor MR-A, a taxa de diluição para a fração 2 ficou abaixo da recomendada por Ruvalcaba (1994) para esse diluidor. Segundo Flowers (1996) as doses inseminantes que têm pequena taxa de diluição, ou seja, menor que 1:5, apresentam baixa viabilidade espermática devido à carência de substratos energéticos e à perda da capacidade tamponante do meio, sendo observado por Alexpoulos et al. (1996) um decréscimo significativo da
motilidade espermática em doses inseminantes com menor diluição, quando comparadas às apresentando maiores taxas de diluição.
Entretanto, considerando-se a taxa de diluição de 1:35 utilizada para a fração 1, observa-se estarem os valores muito acima das recomendadas pela literatura, havendo relatos de uma redução da qualidade espermática quando os espermatozóides são submetidos à altas taxas de diluição. Razões para a redução da fertilidade e da viabilidade espermáticas em doses inseminantes apresentando altas taxas de diluição (>1:15) não são totalmente compreendidas, embora possa estar envolvido um fenômeno denominado choque osmótico (Flowers, 1996; Levis, 1997).
Dentro desse contexto merece ênfase, um trabalho utilizando sêmen eqüino (Varner et al., 1987) quando observou-se ser mais importante dar ênfase ao número de células espermáticas por mL de sêmen diluído, em detrimento da taxa de diluição, sendo que esse valor deveria estar no intervalo de 30 a 50 x 106 de espermatozóides por mL de sêmen diluído. Dentro dessa premissa, observa-se que tanto as doses oriundas da fração 1 quanto as da fração 2 atendem à proposta de Varner et al. (1987).
Observa-se na tabela 13, que o tempo médio da colheita do sêmen à pré-diluição na fração 1 foi de 3,80 minutos. Considerando-se que não foi realizado a pré-diluição na fração 2, esse dado não está presente na tabela. O tempo da colheita do sêmen à diluição foi similar (p>0,05) entre as duas frações do ejaculado. Entretanto, o tempo da colheita do sêmen ao início do resfriamento, diferiu (p<0,05) entre as frações, sendo superior na fração 1. Isso pode ser explicado pelos diferentes horários registrados, da chegada das frações ao laboratório. Dessa forma, após a rápida
coleta da fração 1e seu envio ao mesmo, necessitava-se de um tempo adicional para a coleta da fração 2. Diante disto, como as doses eram resfriadas concomitantemente, ao longo de todo experimento, sempre houve uma diferença no intervalo de tempo
da colheita ao resfriamento entre as frações do ejaculado.
Na tabela 14 estão apresentados os dados referentes à cor e aspecto do sêmen observado entre as duas frações coletadas. Tabela 14. Influência da fração do ejaculado sobre a cor/aspecto do sêmen in natura no Experimento I
Fração do ejaculado
Cor/aspecto do sêmen
Leitoso (%) Soroso-leitoso(%) Soroso (%)
1 100,0 (10/10) 0,00 0,00
2 50,0 (5/10) 50,0 (5/10) 0,00
Nota-se que em decorrência da grande concentração espermática presente na fração 1 do ejaculado, todas as coletas (100,00%) apresentaram aspecto leitoso. Entretanto, observa-se que na metade das frações 2 (50,00%), o grande volume de plasma seminal da fração pós-espermática e a menor concentração espermática encontrada nessa fração, fez com que o sêmen apresentasse aspecto soroso-leitoso. Em nenhuma das coletas, observou-se o
aspecto soroso para qualquer uma das frações.
Com relação ao número de aglutinações observado nas duas frações, em todas as coletas, a fração 1 apresentou somente de 1 a 2 aglutinações. De forma similar, na grande maioria das vezes (90,0%), a fração 2 também apresentou somente de 1 a 2 aglutinações no sêmen (tabela 15).
Tabela 15. Número de aglutinações no sêmen in natura de acordo com a fração do ejaculado, no Experimento I Fração do ejaculado Número de aglutinações 1 a 2 3 a 5 ≥ 6 1 100,0 (10/10) 0,00 0,00 2 90,0 (9/10) 10,0 (1/10) 0,00
Finalmente, um importante aspecto a ser considerado na tabela 13, refere-se ao número potencial de fêmeas a serem inseminadas por cada fração do ejaculado, de 6,36 ± 0,75 e 12,45 ± 1,26 para as frações 1 e 2, respectivamente.
Recentemente, Braga (2007) trabalhou com varrões das raças Landrace e Large White, pertencentes à mesma empresa (DanBred do Brasil), e observaram um número potencial de fêmeas a serem inseminadas por ejaculado de 18,26 ± 6,21 e 20,49 ± 7,05, respectivamente, sendo o número médio, envolvendo as duas raças de 19,14 ± 6,57 doses produzidas/ejaculado. Assim, os
resultados do presente experimento, considerando-se as doses produzidas pelas duas frações (18,81 doses), aproxima-se dos apresentados, anteriormente, por Braga (2007), embora trabalhassem com doses inseminantes oriundas do ejaculado total.
Vale salientar o baixo volume utilizado para produzir 6 doses inseminantes, na fração 1. Comparando-se os volumes inseminantes utilizados na indústria da inseminação artificial envolvendo os bovinos, eqüinos, caprinos, ovinos e outros, verifica-se o quão difícil é estabelecer protocolos que envolvem o resfriamento e transporte ou o congelamento do sêmen de varrões. Saravia
et al. (2010) propôs a utilização deste importante conhecimento da coleta fracionada do sêmen, visando a simplificação dos procedimentos relacionados à criopreservação, eliminando- se um item importante do processo, capaz de concentrar sobremaneira o ejaculado do suíno, que é a centrifugação. É nossa proposta, ao final destes experimentos, propor um novo protocolo de coleta, diluição, resfriamento e transporte do sêmen, envolvendo duas diluições a intervalos que estão sendo determinados.
4.1.2 Características físicas do sêmen