Informantenes forklaringer på konsentrasjonen

ATPase induzida por oxometalatos

O facto de a inibição pelo decavanadato ser não competitiva, pode apontar para um modo específico de interação com a Ca2+-ATPase que é claramente diferente da descrita para o vanadato V1. Por outro lado, os estudos de inibição mostraram que o decavanato, o inibidor

mais potente, com o valor de IC50 para a inibição da Ca2+-ATPase (IC50 = 15 µM) que é mais

de duas vezes menor do que o valor de IC50 para o decaniobato (IC50 = 35 µM). Isto mostra

que o decavanadato pode ter uma característica diferente sobre a interação de proteínas. Além disso, alguns estudos, apontam para a oxidação das cisteínas como uma parte fundamental do

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mecanismo de inibição da Ca2+-ATPase pelo decavanadato (Viner et al., 1996; Viner et al., 1999).Também se verificou que o vanadato pode ser reduzido por grupos tiol em condições fisiológicas (Crans et al., 2010), observando-se essa redução particularmente devido a uma interação específica com proteínas, tais como a actina (Ramos et al., 2009 ; Ramos et al., 2010) e também com a Ca2+-ATPase (Viner et al., 1999). Tem sido sugerido que apenas um ou dois resíduos de cisteína (Cys) da Ca2+-ATPase de RS são verdadeiramente importantes para a função da enzima (Viner et al., 1999). Uma modificação da Cys349, localizada perto do local de fosforilação leva e uma modulação da atividade da Ca2+-ATPase pelo peroxinitrito (Viner et al., 1996). Neste caso, a oxidação pode ser revertida com GSH, mas para concentrações elevadas de agentes de oxidação o conteúdo em grupos SH diminui e o efeito não é revertido, isto é, a oxidação é irreversível (Viner et al., 1996). Na verdade, têm sido observados efeitos inibitórios na Ca2+-ATPase promovidos por espécies reativas de oxigénio e de azoto (Viner et al., 1996; Viner et al., 1999), bem como pelo 3-bromopiruvato, conhecido por ser uma substância antitumoral (Jardim-Messeder et al., 2012), em todos estes efeitos parece estar envolvido o processo de oxidação de cisteínas da proteína.

Os resultados deste trabalho indicam que os oxometalatos de vanádio (V1 e V10), em

oposição aos oxometalatos de nióbio, tungsténio e molibdénio, oxidam as cisteínas da Ca2+- ATPase, tendo-se comprovado a redução do vanádio(V) a vanadilo por RPE. Não foi possível fazer, através dos espetros de RPE obtidos, uma análise de que tipo de átomos, possam estar a coordenar o vanádio devido a dados incompletos. Assim, para sugerir quais os átomos envolvidos na coordenação, era necessário recorrer a espetros de complexos com coordenação conhecida, de modo a relacionar a coordenação com os valores dos parâmetros de RPE. Alguns dados, de parâmetros de RPE de complexos de vanadilo com apoferritina, malonato, cianeto entre outros (Chasteen e Thail, 1982) existentes na literatura apresentam valores diferentes dos obtidos para a interação com a Ca2+-ATPase. Os valores descritos, obtidos por RPE, para o complexo vanádio(IV)/F-actin: az (paralelo) = 195,6G; ax,y (perpendicular) = 65 G; gz (paralelo) = 1,9399; gx,y (perpendicular) = 1,998 (Ramos et al., 2009) também são diferentes, o que sugere que os diferentes complexos com o ião vanadilo originam valores específicos dos sinais de RPE. Contudo, o valor de gz = 1,9625 obtido está de acordo com o referenciado para o valor de gz para o vanadilo em espetros de RPE, que em geral são inferiores ao valor teórico para o eletrão livre, observando-se em geral para o vanadilo um valor de cerca de 1,95 para o gz (Smith et al., 2002).

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Relativamente ao efeito da presença de antioxidantes, a presença de GSH, quercetina ou canferol, não revertem a inibição induzida pelos oxometalatos, apesar de se ter verificado uma reversão da oxidação da cisteína pelo vanadato em presença de quercetina. Portanto, os resultados sugerem que o vanadato induz oxidação da cisteína, mas que esta oxidação não modula a atividade da Ca2+-ATPase.

Provavelmente, os resíduos de cisteína que estão localizados próximo ao local de ligação de nucleótidos, tais como Cys675 ou Cys674, não são particularmente importantes na modulação da atividade da enzima. Por outro lado têm sido descrito que a ligação do decavanadato à Ca2+-ATPase pode envolver todos os três domínios citoplasmáticos, mas mais perto do local de fosforilação da proteína (Hua et al., 2000; Toyoshima et al., 2000). A ligação do decavanadato prevê que a molecula de V10 encaixa na proteína como uma bola, o

que impede a mudança para a conformação que permite a libertação do Ca2+ (Toyoshima et

al., 2000). Este local de ligação poderia explicar o efeito inibitório que o decavanadato

apresenta na Ca2+_{-ATPase. Num outro estudo, observaram-se resultados similares aos obtidos}

neste trabalho, assim verificou-se que a Ca2+-ATPase de RS de musculo-esquelético de coelho foi oxidada por Fe2+/H2O2, sistema que gera radicais hidróxilo por reação de tipo Fenton, e a

sua atividade inibida em 50 %. O uso de dois antioxidantes, trolox e stobadina, previnem a oxidação dos grupos tiol (SH) e a peroxidação lipídica mas não previnem a diminuição da atividade da Ca2+-ATPase (Voss et al., 2008). Contudo, a reversão da atividade por antioxidantes foi observada num estudo recente, em que o t-BHP (tert-butil-hidroperóxido), molécula que gera a produção de ROS, diminui significativamente a atividade da Ca2+- ATPase de membranas de hepatócitos de rato, sendo essa atividade revertida em 40 % por GSH e 20 % pelo antioxidante sintético BHT (butil-hidroxitolueno), tendo sido sugerido que a inibição da Ca2+-ATPase envolve a oxidação de grupos tiol (Singh et al., 2012).

Salienta-se ainda que os estudos efetuados no presente trabalho, em que se utilizaram soluções de decavanadato teve-se em conta que a espécie V10 tem um tempo de semivida entre 5 e 12 horas, a 25 ºC, e cerca de 3 horas a 37 ºC dependendo do meio (composição da solução) e temperatura em que se efetuam os ensaios (Aureliano et al., 2002; Soares et al., 2007a; Soares et al., 2007b; Soares et al., 2007d; Soares et al., 2008a).

A maior parte dos estudos com espécies de vanádio ou com complexos complexos orgânicos de vanádio não têm em conta a estabilidade das soluções de vanádio. Neste estudo, a maioria dos ensaios não foram além dos 10 a 30 minutos e à temperatura ambiente de aproximadamente 25 ºC, pelo que o tempo de duração dos ensaios é muito menor que o tempo

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de semivida determinado para o V10 de modo a assegurar que os efeitos biológicos são devidos maioritariamente à presença do V10 nas soluções deste oxometalato (Aureliano e Madeira, 1994a; Aureliano et al., 2002; Soares et al., 2007b; Soares et al., 2007d; Soares et al., 2008; Aureliano, 2009; Aureliano e Crans, 2009; Ramos et al., 2009; Ramos et al., 2010). Se não se tivesse em conta a estabilidade das espécies ou complexos de vanádio apenas se poderia especular sobre a origem dos efeitos observados. De facto tem sido mostrado por RMN que estes compostos de vanádio, podem em solução originar a complexos de vanádio com diferentes estados de oxidação (Aureliano et al., 2008). Portanto, além dos fatores conhecidos da complexidade química que o vanádio apresenta, nomeadamente os múltiplos estados de oxidação, a semelhança existente entre o vanadato e o fosfato, a ocorrência de vários oligómeros de vanádio em solução e a possibilidade de formação de complexos de vanádio com várias moléculas que apresentam atividade biológica com interesse, pode-se adicionar ainda, a importância de determinar a estabilidade das espécies de vanádio ou complexos de vanádio em solução, antes de, como referido na secção anterior (secção 5.2), se especular sobre os efeitos.

5.3 Interação de oxometalatos com a Ca2+-ATPase por espetroscopia de absorção