Funn fra surveyundersøkelsen

O estado de pureza das preparações de Ca2+-ATPase isoladas foi analisado por eletroforese em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes na presença de dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE), método que separa e identifica as proteínas de acordo com a sua massa molecular (Hames, 1998; Weber e Osborn, 1969).

A eletroforese descreve a migração de partículas carregadas quando sujeitas a um campo elétrico. A SDS-PAGE (Eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio) é uma técnica bastante utilizada para monitorizar o processo de purificação de uma proteína, uma vez que se baseia na separação das proteínas de acordo com o seu tamanho, e pode ser também utilizada para determinar a massa molecular de proteínas.

O SDS é um detergente aniónico capaz de ligar fortemente às proteínas e é utilizado no tratamento das amostras. Numa primeira fase as proteínas sofrem uma desnaturação térmica, em tampão de amostra contendo β-mercaptoetanol (agente redutor das ligações dissulfito) e SDS. O primeiro composto é utilizado para quebrar as ligações dissulfito (S-S) envolvidas na estrutura terciária da proteína enquanto o SDS auxilia a desnaturação ligando- se fortemente à proteína anulando todas as cargas positivas existentes. Cada molécula de SDS liga dois resíduos de aminoácido, o que confere uma carga total negativa à proteína desnaturada proporcional à sua massa e qualquer tentativa de “folding” proteico irá resultar numa repulsão eletrónica por parte das moléculas de SDS (Wilson e Walker, 2005).

Assim, quando uma mistura de proteínas, todas carregadas negativamente devido ao SDS, mas com massas diferentes, é submetida a um campo elétrico, as proteínas migram a diferentes velocidades em direção ao ânodo do aparelho eletroforético (Hames, 1998) dependendo da respetiva massa molecular. A mobilidade eletroforética das proteínas será tanto maior quanto menor a sua massa molecular (Wilson e Walker, 2005; Voet e Voet, 2011), tal como seguidamente se explica.

A velocidade de migração das proteínas (v) é diretamente proporcional à diferença de potencial aplicada a uma carga (Eq) e inversamente proporcional à resistência provocada pela fricção das proteínas ao longo do gel. A fricção exercida pelas moléculas é medida através do tamanho da proteína, da forma da proteína, pelo tamanho da rede criada pelo gel de

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poliacrilamida e pela viscosidade do tampão, v= Eq f⁄, em que f é o coeficiente de fricção. O coeficiente de fricção depende da viscosidade do meio, η , e do raio da molécula, r ( 6 ). Normalmente a mobilidade eletroforética (μ) é a razão entre a velocidade e a diferença de potencial (E), μ = v E⁄ , substituindo o v, temos μ = q f⁄, em que q é a carga da molécula (constante). Consequentemente a migração das moléculas depende exclusivamente da relação carga/massa e da resistência que estas oferecem à rede criada pelo gel (Mikkelsen e Cortón, 2004; Wilson e Walker, 2005; Voet e Voet, 2011). Como a carga da molécula é a mesma a velocidade de migração só depende do coeficiente de fricção (f ) que é proporcional à massa da proteína.

As eletroforeses foram efetuadas num sistema SDS mini-protean descontínuo constituído por dois géis de diferentes concentrações: o gel de separação de 7,5 % de acrilamida e o gel de concentração de 4% de acrilamida de acordo com a tabela 3.3.

O gel de concentração permite concentrar a amostra numa banda densa de acordo com as massas moleculares antes de os componentes serem resolvidos (Robyt e White, 1996) enquanto o gel de separação a 7,5 % de acrilamida é o ideal para o fracionamento de uma mistura de proteínas (Hames, 1998) na ordem das massas moleculares que se encontram nas VRS.

Tabela 3.3 - Reagentes e volumes utilizados na preparação dos géis de separação e concentração.

Reagentes Gel de separação 7,5 % Gel de concentração 4 %

(µL) (µL) Acrilamida 30 % 1250 400 Tampão Tris-HCl 1,5 M pH 8.8 1250 - Tampão Tris-HCl 1,5 M pH 6.8 - 750 SDS 10% 50 30 H2O 2420 1800 PSA 10% 25 15 TEMED 3.33 5 Volume final 5000 3000

Preparou-se o gel de separação com uma percentagem de poliacrilamida de 7,5%, adicionando-se, pela seguinte ordem e com os volumes indicados na tabela 3.3, uma solução

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de acrilamida 30 % (m/v), tampão de separação (1,5 M Tris-HCl, pH 8,8; 4x concentrado), SDS 10 % e água com resistividade de 18,2 MΩ•cm a 25 °C. Por fim para promover a polimerização adicionou-se PSA 10 % e TEMED como catalizador. Agitou-se e colocou-se a polimerizar no sistema de vidros da eletroforese previamente montados. Colocou-se água de modo a impedir a desidratação do gel e impedindo o contacto do mesmo com o oxigénio. Após a polimerização, cerca de 30 minutos, retirou-se a H2O e preparou-se o gel de concentração, 4% acrilamida. Para tal adicionou-se pela seguinte ordem e com os volumes indicados na tabela 3.3, uma solução acrilamida 30 %, tampão de concentração (0,5 M Tris, pH 6,8; 4 vezes concentrado), SDS 10 %, água com resistividade de 18,2 MΩ•cm a 25 °C e por fim PSA 10 % e TEMED. Após agitação suave colocou-se sobre o gel de separação deixando-se polimerizar durante cerca de 30 minutos. Após a polimerização transferiu-se o gel para a tina de eletroforese, na qual foi adicionado o tampão de eletroforese do ânodo (Tris 25 mM, glicina 192 mM; SDS 0,1% (m/v) e acetato de sódio 0,1 M, pH 8,3) e o tampão de eletroforese do cátodo (Tris 25 mM, glicina 192 mM e SDS 0,1% (m/v), pH 8,3). As amostras foram preparadas para um volume final de 100 μL dos quais apenas 25 μL correspondem ao tampão de amostra (Tris-HCl 320 mM, pH 6,8; β-mercaptoetanol 0,4 M, SDS 8%, glicerol 15% (v/v) (confere densidade à amostra) e azul de bromofenol 0,024 % (marcador da frente de migração). Colocaram-se as amostras em água a ferver durante 5 minutos e adicionou-se aos poços 20 μL de cada amostra retirada do isolamento da proteína. Reservou-se um poço de cada gel para adicionar 5 μL de solução de marcadores proteicos de baixa massa molecular (LMW) e outra para o marcador de alta massa molecular (HMW) (Tabela 3.4). Aplicou-se um campo elétrico de 100 V ao gel durante aproximadamente 1 hora.

No final da migração, retirou-se o gel e colocou-se numa tina com solução corante contendo (“Coomassie Brilliant Blue” 0,2% com metanol 45% (v/v) e ácido acético glacial 10%) aproximadamente 1 hora. Após coloração deixou-se o gel em solução descorante (metanol 10% (v/v) e de ácido acético glacial 10% (v/v) até ser possível clarificar as bandas presentes, para tal substitui-se a solução descorante várias vezes.

A massa molecular das proteínas foi determinada interpolando-se as suas mobilidades eletroforeticas relativas e efetuando-se a curva padrão log (massa molecular) versus Rf, relação linear de acordo com a equação 3.2.

Rf mobilidade relativa =migração da proteína (mm)

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Através desta e por interpolação da mobilidade das bandas presentes nas amostras é possível concluir o grau de pureza das proteínas (Mikkelsen e Cortón, 2004; Wilson e Walker, 2005; Voet e Voet, 2011).

Posteriormente, procedeu-se à análise densitométrica dos géis usando o programa Quantity One Version 4.2.1 para a determinação da quantidade relativa da Ca2+-ATPase nas VRS que foram isoladas.

Tabela 3.4 – Marcadores moleculares utilizados na SDS-PAGE. Marcadores moleculares (Sigma)

HMW kDa LMW kDa

Miosina 205 Albumina 66

β-galactosidade 116 Ovalbumina 45

Fosforilase b 97 Gliceraldeído-3-P-desidrogenase 36

Fritose-6-P-cinase 84 Anidrase carbónica 29

Albumina 66 Tripsinogénio 24

Desidrogenase Glutâmica 55 Inibidor da tripsina 20

Ovalbumina 45 α-lactalbumina 14,2

Gliceraldeído-3-P-desidrogenase 36 Aprotinina 6,5