Empiriske illustrasjoner

diferentes conformações por EAA

Os primeiros ensaios realizados para avaliar a interação passaram por incubar soluções contendo a Ca2+_{-ATPase em meios que induziam as conformações E1, E1P, E2 e E2P com as} espécies de vanádio V1 e V10.

Quando se incubaram resultados quantidades equimolares (1 µM) de proteína com V1 e V10, na proporção 1:1 metal:proteína, verificou-se que no meio quando a Ca2+_{-ATPase se} encontra induzida na conformação E1, cerca de 39 % do total de vanádio encontrou-se na forma ligada quando se utilizou soluções contendo V10. Quando a incubação foi realizada com V1, apenas cerca de 4% do vanádio total encontrou-se de forma ligada (Fig. 4.16).

A pequena quantidade de V1 que se liga à conformação E1 ou E1P está de acordo com o já referenciado anteriormente, uma vez que o vanadato liga-se preferencialmente à conformação E2 relativamente à conformação E1 (Dupont e Bennet, 1982; Aureliano e Madeira, 1994a). Esta afirmação pode ser confirmada (Fig 4.16), quando se incubou V1 com a Ca2+-ATPase, num meio contendo um agente quelante tal como o ácido etilenoglicoltetracético (EGTA), situação em que a conformação E2 é induzida. Neste caso, a quantidade de V1 ligada aumenta cerca de 6-7 vezes relativamente ao que se observa quando a proteína foi induzida para a sua conformação E1. Quando a proteína foi induzida numa conformação E2 a quantidade de V1 ligado acerca-se a valores da ordem dos 30 % relativamente à quantidade total de V1 presente no ensaio (Fig. 4.16).

Este aumento de ligação do V1 não é revertido pela presença de fosfato, uma vez que quando se induziu a conformação E2P a quantidade de V1 ligado determinado nas condições experimentais que induzem a conformação E2P é semelhante ao determinado quando se induziu a conformação E2.

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Figura 4.16 - Análise das espécies de vanádio V1 e V10 ligadas nas diferentes conformações da Ca2+-ATPase de RS por espetroscopia de absorção atómica (EAA). Amostras contendo Vanadato (V1) ou decavanadato (V10) com a concentração de 1 μM para ambas as espécies de vanádio e igual concentração de Ca2+-ATPase de RS (1 μM), num meio contendo: KCl 0,1 M, HEPES 25 mM pH 7,0 e MgCl2 5 mM e a) CaCl2 50 µM (+Ca/-ATP); b) CaCl2 50 µM e ATP 2,5 mM (+Ca/+ATP); c) EGTA 0,5 mM (+EGTA); d) EGTA 50 mM e fosfato 5 mM (+EGTA/+Pi), foram centrifugadas de acordo com o descrito na secção 3.7.7 e os sobrenadantes foram analisados no seu conteúdo em vanádio. Amostras controlo de V1 e V10 com a mesma concentração, 1 μM, na ausência de Ca2+_{-ATPase de RS foram tratadas nas} mesmas condições e nos diferentes meios. Os resultados obtidos correspondem à média ± desvio padrão e resultam da análise em triplicado de um mínimo de três preparações diferentes de VRS para cada condição experimental. *Significativamente diferente do controlo (p < 0,05).

Ao contrário da interação do vanadato com a Ca2+-ATPase, a interação de V10 aparentemente não é afetada pelas diferentes conformações da Ca2+-ATPase de RS, uma vez que não se observam diferenças significativas entre as quantidades de V10 ligado em qualquer das conformações (Fig. 4.16). Estes resultados estão de acordo com os observados em estudos de interação por espetroscopia de RMN (Aureliano e Madeira, 1994a).

Na presença de cálcio (50 µM) e ATP (2,5 mM), ou seja quando a conformação E1P foi induzida observou-se uma pequena diminuição da quantidade de V10 ligado, de 39 para 33%, enquanto a quantidade de V1 ligado apresentou um ligeiro aumento de 4 para 7 %. Este efeito oposto ao do ATP na interação de ambas as espécies V10 e V1 já havia sido descrito na interação com a Ca2+-ATPase (Aureliano e Madeira, 1994b) ou na interação com actina ou

* * * * 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00

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miosina (Tiago et al., 2004a; Ramos et al., 2009; Ramos et al., 2011; Ramos et al., 2012). Muito embora se tenha observado esta tendência, as diferenças não são significativas para a ligação de cada oxometalato nas conformações E1 e E1P. As diferenças são consideradas significativas (p < 0,05) se considerarmos a interação de V10 e V1 quer seja na ligação à conformação E1 ou E1P. Assim, V10 liga-se a qualquer conformação da enzima enquanto V1 apenas liga nas conformações E2 e E2P.

Verificou-se ainda que não existem diferenças significativas para a ligação do V10 à Ca2+-ATPase nas conformações E1 e E1P em várias proporções metal:proteína (Fig. 4.17), o mesmo acontecendo para as conformações E2 e E2P, relativamente ao V10. Contudo, parece haver uma tendência para uma ligeira menor ligação para as conformações fosforiladas, E1P e E2P (Fig. 4.18).

Figura 4.17 - Análise da ligação V10-Ca2+-ATPase de RS nas conformações E1 e E1P, após incubação com proporções metal proteína (1:2; 1:1; 2:1;10:1) em µM, por EAA num meio contendo: KCl 0,1 M, HEPES 25 mM pH 7,0 e MgCl2 5 mM e a) CaCl2 50 µM (+Ca/-ATP); b) CaCl2 50 µM e ATP 2,5 mM (+Ca/+ATP). As amostras foram centrifugadas de acordo com o descrito na secção 3.7.7 e os sobrenadantes foram analisados no seu conteúdo em vanádio. Amostras controlo de V10 com a mesma concentração, 1 μM, na ausência de Ca2+-ATPase de RS foram tratadas nas mesmas condições e nos diferentes meios. Os resultados obtidos correspondem à média ± desvio padrão e resultam da análise em triplicado de um mínimo de três preparações diferentes de VRS para cada condição experimental.

0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60 0,70 0,80 1:02 1:01 2:01 10:01 V anádio ligado [µM] [V10]/[Proteína] V10 +Ca/-ATP V10 +Ca/+ATP

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Figura 4.18 - Análise da ligação V10-Ca2+-ATPase de RS nas conformações E2 e E2P, após incubação com proporções metal:proteína (1:2; 1:1; 2:1;10:1) em µM, por EAA num meio contendo: a) KCl 0,1 M, HEPES 25 mM pH 7,0, MgCl2 5 mM e EGTA 0,5 mM (+EGTA); b) EGTA 50 mM e fosfato 5 mM (+EGTA/+Pi). As amostras foram centrifugadas de acordo com o descrito na secção 3.7.7 e os sobrenadantes foram analisados no seu conteúdo em vanádio. Amostras controlo de V10 com a mesma concentração, 1 μM, na ausência de Ca2+-ATPase de RS foram tratadas nas mesmas condições e nos diferentes meios. Os resultados obtidos correspondem à média ± desvio padrão e resultam da análise em triplicado de um mínimo de três preparações diferentes de VRS para cada condição experimental.

4.2.5.2 Determinação da estequiometria de ligação V10-Ca2+-ATPase de RS e da

constante de dissociação (Kd) por EAA

Nas condições experimentais correspondentes à conformação E1, determinou-se a estequiometria de ligação V10-Ca2+-ATPase. Usando o método de Job modificado, verificou- se que a quantidade de V10 ligado aumenta linearmente com a razão V10/proteína até aproximadamente à razão 1:1, obtendo-se a saturação, a valores de vanádio ligado equimoleculares com a quantidade de proteína, o que indica uma estequiometria 1:1 (Fig. 4.19). 0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60 0,70 1:02 1:01 2:01 10:01 V anádio ligado [µM] [V10] /[Proteína] V10 + EGTA V10 + EGTA /+ Pi

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Figura 4.19 - Determinação da estequiometria de ligação V10:Ca2+-ATPase de RS pelo método de Job modificado. Foram incubadas amostras Ca2+-ATPase de RS contendo 1 µM com concentrações de V10 entre 0 e 2 µM, num meio contendo KCl 0,1 M, HEPES 25 mM pH 7,0, MgCl2 5 mM e CaCl2 50 µM. Após centrifugação de acordo com o descrito na secção 3.7.7, os sobrenadantes foram analisados no seu conteúdo em vanádio por EAA. Amostras controlo de V10 com as mesmas concentrações, na ausência de Ca2+-ATPase de RS, foram tratadas nas mesmas condições. Os resultados obtidos correspondem à média ± desvio padrão e resultam da análise em triplicado de um mínimo de três preparações diferentes de VRS para cada condição experimental.

A estequiometria 1:1, entre metal:proteína determinada por EAA foi confirmada por aplicação do método de Job tradicional em se usam razões diferentes de metal:proteína. (Fig. 4.20).

Figura 4.20 - Determinação da estequiometria de ligação V10:Ca2+-ATPase de RS pelo método de Job. Foram incubadas amostras Ca2+-ATPase de RS contendo entre 0 e 1 µM com concentrações de V10 entre 0 e 1 µM e nas seguintes proporções V10:proteína (µM) (1:0, 4:1, 3:2, 2:3, 1:4 e 0:1) num meio contendo KCl 0,1 M, HEPES 25 mM pH 7,0, MgCl2 5 mM e CaCl2 50 µM. Os resultados obtidos correspondem à média ± desvio padrão e resultam da análise em triplicado de um mínimo de três preparações diferentes de VRS para cada condição experimental. 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 0 0,5 1 1,5 2 2,5 V anádio ligado [µ M ] [Decavanadato]/[Proteína] 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 V anádio ligado [µM] Proteína [µM]

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A constante de dissociação (Kd) de V10 para a Ca2+-ATPase é um parâmetro muito poucas vezes referido na literatura, existem estudos efetuados usando isotiocianato de de fluoresceína em que por espetrofotometria de fluorescência (FITC) foi determinado para o vanadato um Kd na ordem dos µM-1 (Highsmith et al., 1985). Neste trabalho também foi determinada a constante de dissociação entre o V10 e Ca2+-ATPase utilizando a EAA. Os resultados foram analisados pelo método de Scatchard, usando as seguintes proporções entre metal e proteína: 1:4, 1:2, 1:1, 2:1, 10:1 e 20:1. (Fig. 4.21)

  Figura 4.21 - Análise da interação entre V10 e Ca2+-ATPase de RS pelo método de Scatchard. Os ensaios foram realizados com as seguintes razões entre metal e proteína (µM): 1:4, 1:2, 1:1 2:1,10:1 e 20:1 num meio contendo KCl 0,1 M, HEPES 25 mM pH 7,0, MgCl2 5 mM e CaCl2 50 µM. Após centrifugação de acordo com o descrito na secção 3.7.7, os sobrenadantes foram analisados no seu conteúdo em vanádio por EAA. Amostras controlo de V10 com as mesmas concentrações, na ausência de Ca2+-ATPase de RS, foram tratadas nas mesmas condições. Os resultados obtidos correspondem à média ± desvio padrão e resultam da análise em triplicado de um mínimo de três preparações diferentes de VRS para cada condição experimental.

O valor obtido para a constante de dissociação (Kd) 1,07 µM-1 para a interação entre V10 e Ca2+-ATPase de RS é muito semelhante aos valores descritos para o cálcio, magnésio e ATP, respetivamente 1, 0,9 e 1  µM-1 (Gonzalez et al., 2006). A partir desta análise, obteve-se o valor máximo de concentração de V10 ligado de 1,11 µM que vem confirmar novamente a estequiometria de ligação 1:1 entre V10 e a Ca2+-ATPase, sugerindo que existe uma molécula de V10 por cada Ca2+-ATPase (Fig. 4.21).

0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00

[V

anádio ligado]/

[ligando livr

e]

Vanádio ligado [µM]

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