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14 Material e Métodos

3.2.3. Triagem química dos extratos brutos obtidos do cultivo em escala piloto Os extratos obtidos foram submetidos à análise através de cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC) em fase normal e a revelação foi realizada sob luz UV (254 e 365 nm), em câmara saturada de iodo sublimado, com solução de anisaldeído e iodo platinado.

Para as análises por cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa foi utilizada coluna analítica C18 Supelco (5µm x 4,4mm x 25cm), como fase móvel gradiente de acetonitrila em água e fluxo de 1 ml/min. Foi utilizado o cromatógrafo Shimadzu, modelo SCL-10AVP, equipado com detector de arranjo de diodos UV-Vis DAD Shimadzu, modelos SPD-M10AVP e sistema de integração computadorizado com software CLASS-VP.

As análises de RMN de 1H foram realizadas nos espectrofotômetros BRUKER DRX 400 E BRUKER DRX 500, operando respectivamente em a 400 e 500 MHz para experimentos de 1H e em 100 e 125 MHz para os experimentos de 13C. Ambos os equipamentos estão localizados no Departamento de Química da Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto, USP.

3.2.4. Ensaio para avaliação da atividade antibacteriana

Os experimentos para a avaliação de atividade antibacteriana foram realizados no Departamento de Ciências Farmacêuticas da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, USP, no laboratório de Farmacognosia, sob supervisão da Profa. Dra. Niege A.J.C. Furtado.

As bactérias utilizadas no experimento foram: Staphylococcus aureus ATCC 25923 (gram positiva) e Escherichia coli ATCC 25922 (gram negativa). Para determinação da concentração inibitória mínima (CIM) foi utilizado o método de microdiluição em microplaca segundo a metodologia preconizada pelo “National Committee for Clinical Laboratory Standards” (NCCLS, 2003), com adaptações. Para determinação da Concentração Bactericida Mínima (CBM), após a revelação das placas de MIC, amostras dos poços da microplaca foram transferidas para Placas de Petri contendo Meio Ágar Mueller Hinton e observou-se o crescimento bacteriano após incubação a 37°C por 24 horas.

3.2.5. Ensaio para avaliação da atividade antitumoral

Os experimentos de atividade antitumoral foram realizados no Laboratório de Oncologia Experimental do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Universidade Federal do Ceará, sob a responsabilidade da Profa. Dra. Letícia Veras Costa-Lotufo.

15 Material e Métodos

Foram realizados testes de citotoxicidade através do método do MTT, utilizando a linhagem celular: HCT-116 (cólon humano), em concentração única de 50 µg/mL, para a seleção dos extratos mais ativos. Os extratos e frações ativas frente à linhagem HCT-116, foram também testadas nas seguintes linhagens: HL-60 (leucemia); OVCAR-8 (câncer de ovário); SF-295 (gliobastoma); PC-3M (câncer de próstata) e uma linhagem de célula normal MRC-5 (célula normal de pulmão), para verificação da seletividade e especificidade da atividade citotóxica da amostra.

As células serão cultivadas em meio de cultura contendo 10% de soro fetal bovino e 1% de antibióticos, mantidas a 37ºC em atmosfera de 5% de CO2. As células foram plaqueadas na concentração 0,5 x 105 cél/mL. As placas foram incubadas por 72 horas em estufa a 5% de CO2 a 37°C. Como controle positivo foi utilizado a doxorubicina na concentração de 0,3µg/mL.

Ao término do período de incubação, o meio foi aspirado e em seguida, foram adicionados 150 µL da solução de MTT (sal de tetrazolium), e as placas foram incubadas por 3h. A absorbância foi lida após dissolução do precipitado com 150 µL de DMSO puro em espectrofotômetro de placa a 595nm.

3.2.6. Identificação da linhagem M20

A identificação da linhagem M20 foi realizada pela empresa Genotyping Biotecnologia LTDA., utilizando sequenciamento automático por eletroforese capilar no equipamento ABI 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) e alinhamento das sequências de nucleotídeos produzidas com as sequências de referência depositadas no banco de dados GenBank.

3.2.7. Fracionamento dos extratos obtidos do cultivo em escala ampliada

O extrato bruto do cultivo em escala ampliada foi submetido à análise por Cromatografia Líquida a Vácuo (CLV) em fase normal e fase móvel com gradiente crescente de polaridade, obtendo-se 9 frações, de A a I.

- Fração A: 100% Hexano

- Fração B: 90% Hexano e 10% Acetato de etila - Fração C: 80% Hexano e 20% Acetato de etila - Fração D: 60% Hexano e 40% Acetato de etila - Fração E: 40% Hexano e 60% Acetato de etila

16 Material e Métodos

- Fração F: 20%Hexano e 80% Acetato de etila - Fração G: 100% Acetato de etila

- Fração H: 25% Acetato de etila e 75% Metanol - Fração I: 100% Metanol

3.2.8. Análise das frações apolares via CG-EM

Nas análises via CG-EM foi utilizada uma coluna DB-5 (30m x 0,25mm x 0,25 mm), gás hélio como gás carreador, com fluxo de 1,41 ml/min, pressão de 87,1 kPa e aquecimento com programação de temperatura de 60-240°C a 3°C/min e a fibra foi mantida exposta na câmara de injeção por 3 minutos.

3.2.9. Análise das frações de média e alta polaridade via CLAE-DAD

Nas análises das frações via CLAE-DAD foi utilizada coluna analítica C18 Supelco (5µm x 4,4mm x 25cm), como fase móvel gradiente de acetonitrila em água e fluxo de 1 ml/min. Foi utilizado o cromatógrafo Shimadzu, modelo SCL-10AVP, equipado com detector de arranjo de diodos UV-Vis DAD Shimadzu, modelos SPD-M10AVP e sistema de integração computadorizado com software CLASS-VP.

3.2.10. Isolamento das substâncias S1 a S6

As substâncias S1 a S6 foram isoladas do extrato da linhagem Hypocrea lixii (M20) cultivada em arroz por 21 dias. A substância S1 foi isolada a partir da fração M20G, através de lavagem do precipitado formado com Diclorometano, uma vez que a substância S1 se mostrou insolúvel neste solvente.

As substâncias S2 e S3 foram isoladas a partir da fração M20E via CLAE em escala semi-preparativa. Utilizou-se coluna Coluna Supelcosil LC-18 (25cm x 10mm x 5µm) e fase móvel com gradiente exploratório 5-50% de Acetonitrila em água, por 40 min, seguido de 50- 100% de Acetonitrila em água por 5 minutos e vazão 4ml/minuto.

Já a substância S4 foi isolada da fração M20I após realização de uma coluna clássica, com sílica gel e fase móvel gradiente de diclorometano-metanol. Na última etapa, as substâncias S5 e S6 foram isoladas a partir da fração M20F via CLAE em escala semi- preparativa. Utilizou-se coluna Coluna Supelcosil LC-18 (25cm x 10mm x 5µm) e fase móvel com gradiente exploratório 5-20% de Acetonitrila em água, por 10 min, seguido de 20-50% de Acetonitrila em água por 30 minutos e 50-100% de Acetonitrila em água por 10 minutos e vazão 5ml/minuto. A Figura 5 a seguir ilustra o fluxograma do processo de isolamento.

17 Material e Métodos

Figura 5. Fluxograma do isolamento das substâncias S1-S6 a partir do extrato bruto do fungo Hypocrea lixii, cultivado em arroz por 21 dias.

3.2.11. Isolamento da substância S7

A substância S7 foi isolada a partir do extrato da linhagem Eutypella sp (M23) cultivada em meio líquido PDB por 28 dias. Após o fracionamento via CLV, a fração M23B (90% Hexano: 10% Acetato de Etila) foi submetida à CCDP em placas de sílica e fase móvel Hexano : Acetato de Etila (7:3), o que possibilitou a separação de três manchas.

A mancha 3 (amostra M23B3) foi submetida a separação via CLAE semi-preparativa, resultando no isolamento da substância S7. Para a realização da CLAE, foi utilizada coluna Coluna Supelcosil LC-18 (25cm x 10mm x 5µm) e fase móvel com gradiente exploratório 70- 100% de Acetonitrila em água, por 25 min e vazão 5ml/minuto.

3.2.12. Identificação estrutural das substâncias isoladas

Para a elucidação estrutural das substâncias isoladas foram utilizadas as seguintes técnicas espectrométricas: RMN uni e bidimensional, Espectrometria de massas de alta resolução, Espectroscopia de absorção na região do infravermelho.

A

Extração com CH2Cl2:MeOH (2:1) 3x

Fracionamento via CLV Sílica Gel FM: Gradiente Hex-AcOEt-MeOH Metodologias de Separação A: CLAE semi-preparativa B: Lavagem com CH2Cl2

C: CC (sílica gel) – FM: CH2Cl2-MeOH

18 Material e Métodos

3.2.13. Ensaio para avaliação da atividade antifúngica frente espécies de

Candida spp

Os experimentos para a avaliação de atividade antifúngica foram realizados no Departamento de Ciências Farmacêuticas da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, USP, no laboratório de Farmacognosia, sob supervisão da Profa. Dra. Niege A.J.C. Furtado.

Foram utilizadas as seguintes cepas: Candida albicans ATCC, Candida tropicalis ATCC 750, Candida krusei ATCC 34135, Candida parapsilosis ATCC 22019, Candida glabrata ATCC 2001. Como controle positivo utilizou-se Fluconazol. Para determinação da concentração inibitória mínima (MIC) foi utilizado o método de microdiluição em microplaca segundo a metodologia preconizada pelo “National Committee for Clinical Laboratory Standards” (NCCLS, 2003), com adaptações. Este ensaio foi realizado para as substâncias isoladas S1 e S4.

3.2.14. Ensaio para avaliação da atividade anticolinesterásica por bioautografia Os ensaios para avaliação da atividade anticolinesterásica foram realizados no Instituto de Botânica de São Paulo, sob supervisão da Dra. Maria Cláudia Marx Young. Para a realização do ensaio de atividade anticolinesterásica, amostras das substâncias S1 e S4 (50 µg) foram analisadas em CCDC de sílica gel 60 F254 (Merck). Como controle positivo foi utilizado fisostigmina (0,05 µg).

Após o desenvolvimento da cromatografia, a placa foi borrifada com uma solução de enzima acetilcolinesterase (6,66 U) acrescida de albumina bovina fração V (0,1%). Logo após, a placa cromatográfica foi incubada em uma câmara úmida fechada a 37°C por 20 minutos, e em seguida borrifada com uma mistura da solução etanólica de acetato de 1-naftila (5 mL; 0,25%) e aquosa do sal Fast Blue B (20 mL; 0,25%). Uma coloração roxa aparece em aproximadamente 2 minutos.

O aparecimento de mancha branca, sobre o fundo de coloração roxa indica inibição da atividade da enzima acetilcolinesterase. As cromatoplacas obtidas foram observadas em (λ) 254 nm e 366 nm.

19 Material e Métodos

3.2.15. Ensaio para avaliação da atividade antifúngica por bioautografia

Os ensaios para avaliação da atividade antifúngica em placas de sílica-gel foram realizados no Instituto de Botânica de São Paulo, sob supervisão da Dra. Maria Cláudia Marx Young. Para isso, cepas dos fungos Cladosporium sphaerospermum, obtidos da micoteca do Instituto de Botânica de São Paulo, foram incubadas em meio de cultura BDA a 25ºC por 14 dias. Após esse período foi feita a extração dos esporos com solução de sais e glicose (6:1). A suspensão foi filtrada e armazenada a -18ºC para posterior nebulização nas cromatofolhas.

As amostras (substâncias S1 e S4, 50 µg) e o controle positivo Nistatina (5 µg) diluídos foram aplicados em cromatofolhas. As cromatofolhas foram nebulizadas com uma suspensão de esporos dos fungos (> 2x106 esporos mL-1) em solução de glicose e sais (6:1) e incubadas em câmara úmida a 27ºC por 48 h, no escuro (HOMANS; FUCHS, 1970; RAHALISON et al., 1994). Após o tempo de incubação, zonas claras corresponderam à área de inibição dos fungos pela ação das amostras analisadas.

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