Fisk og marine ressurser

Na década de 70, Berg, Boyer e Cohen demonstraram que os genes podiam ser transferidos de um organismo para outro, ao verificar que a sequência de DNA inserida podia recombinar-se com o DNA do microrganismo hospedeiro, iniciando-se assim o desenvolvimento da tecnologia do DNA recombinante e a criação dos primeiros organismos geneticamente modificados (Alberts, 2005).

1.10.1 Clonagem de DNA recombinante

A tecnologia do DNA recombinante prende-se com a clonagem de genes ou seja, com o isolamento e a propagação de moléculas de DNA idênticas. A clonagem envolve a inserção de DNA num vetor com recurso a enzimas de restrição, que clivam e digerem as regiões dentro das sequências de DNA, e a uma enzima ligase, que liga as extremidades

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livres do DNA, formando um vetor recombinante (Hunt, 2005). Este é, num segundo passo, introduzido numa célula hospedeira compatível, através de um processo de transformação (Linden, 2010). Esta técnica tornou possível o estudo detalhado da estrutura e função de proteínas e a produção de proteínas recombinantes dado que um gene que codifica uma proteína pode ser retirado do seu hospedeiro natural, inserido num vetor de clonagem e introduzido numa bactéria. Deste modo, o gene será expresso e a proteína passará a ser sintetizada pela célula hospedeira compatível, por exemplo em bactérias (Brown, 2003).

1.10.2 Escherichia coli como sistema de expressão de proteínas recombinantes

A escolha do vetor de expressão adequado depende do hospedeiro e da

aplicabilidade das proteínas recombinantes (Brown, 2006). E. coli é o microorganismo mais estudado e explorado nos dias de hoje e, o vasto conhecimento da sua fisiologia, organização genética e consequente descoberta de promotores e repressores específicos no seu genoma, permitiu a sua utilização na produção de proteínas recombinantes (Tian et al., 2011).

O sistema de expressão de proteínas heterólogas em E. coli baseia-se no operão lac (Ettinger et al., 2009). No operão lac (figura 10), o controlo da transcrição é feito pela sequência operadora o, adjacente ao local inicial da transcrição e ao local de ligação da RNA polimerase (região promotora p). A sequência operadora é regulada pelo repressor i, que reprime o operador. O repressor i pode ser desativado na presença de lactose, através da sua ligação ao repressor. Assim, na presença de lactose, o operão estará ativo e os três genes serão traduzidos (Tian et al., 2011).

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Apesar da E. coli ser o micoorganismo mais utilizado como hospedeiro dos sistemas de expressão de proteínas recombinantes, existem algumas limitações no seu uso, como por exemplo:

 A incapacidade de existirem modificações pós-traducionais, comuns em eucariotas;

 As proteínas são produzidas na forma insolúvel, biologicamente inativadas em corpos de inclusão, sendo que a reconstituição da sua atividade biológica carece de custos elevados e diminuem e a sua produtividade;

 A ausência de um sistema de secreção para que a proteína possa ser libertada de forma eficiente para o meio de cultura (Tomazetto et al., 2007)

Geralmente, E. coli é colocada em incubação em condições aeróbias de forma a que haja um maior fornecimento de energia para o metabolismo da síntese proteica (Ahamed & Vermette, 2010), e a uma temperatura ótima de 37º C para a indução do operão lac. Por outro lado, o uso de temperaturas inferiores reduz as alterações metabólicas indesejáveis, como a síntese de proteases, contribuindo para aumentar a solubilidade da proteína (Valdez-Cruz et al., 2010).

O repressor impede a transcrição

Figura 10 - Esquema ilustrativo do funcionamento do operão lac (adaptado de

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1.10.3 Purificação de proteínas

A purificação proteica pode ser realizada por diferentes métodos de concentração ou por métodos de cromatografia. A purificação por método de concentração pode ser feita através da precipitação com sais inorgânicos, solventes orgânicos ou polímeros, ou através da ultracentrifugação (Baneyx et al., 2004). A purificação por cromatografia dispõe de vários métodos e é a técnica de purificação mais utilizada atualmente.

A purificação por cromatografia em gel de filtração baseia-se na separação proteica através da sua massa molecular, utilizando géis com um grau de porosidade definida. Neste tipo de purificação, a separação das proteínas não requer o gasto de energia e os sistemas são de fácil otimização. Contudo, as colunas não permitem a purificação de grandes quantidades de amostra (Patrick et al., 2008).

A purificação por cromatografia de troca iónica baseia-se na carga da proteína que se pretende isolar. Se a proteína apresentar carga positiva deve ser utilizada uma coluna com carga negativa de forma a impedir a passagem de proteínas com carga positiva. Nesta técnica, a afinidade da proteína depende do pH do meio pois este pode alterar a carga da proteína, da temperatura, da força iónica e da natureza do tampão. Na eluição é utilizada uma solução com elevado teor em sal, que vai competir com a ligação da proteína à coluna. A remoção do sal é posteriormente realizada por diálise (Alberts et al., 2002).

A técnica de cromatografia de absorção para purificação de proteínas tem por base a capacidade de algumas proteínas se unirem de forma não covalente a outros ligandos localizados numa matriz de uma coluna adsorvente através de forças de Van der Walls, ligações de hidrogénio ou ainda interações eletrostáticas (Patrick et al., 2008).

A cromatografia por afinidade é um método de purificação de elevada eficiência e baseia-se na especificidade biológica da proteína que se pretende analisar (Alberts et al., 2002). A aplicação de tags de afinidade nas proteínas recombinantes permite a sua deteção e ainda a sua purificação num único passo, sendo o produto final de elevada pureza. As tags apresentam inúmeras vantagens como a prevenção da proteólise (Tang et al., 1997), facilita a renaturação das proteínas (Shi et al., 2005), fornece proteção antigénica à proteína de fusão (Mayer et al., 2004) e pode aumentar a solubilidade (Chen et al., 2005). Por outro lado, os tags podem interferir na conformação da proteína (Chant

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et al., 2005), podendo levar a uma alteração da atividade biológica (Fonda et al., 2002) ou à toxicidade da mesma (Vries et al., 2003), dependendo da localização dos aminoácidos do tag (Bucher et al., 2002). A purificação de proteínas com tags baseia-se nas características resultantes da interação entre o tag e um ligando da proteína recombinante, do sistema de expressão e ainda da aplicação da proteína purificada. Os tags mais utilizados são as polihistidinas (HIS), a glutationa S-transferase (GST), a proteína verde fluorescente (GFP) e a Maltose Binding Protein (MBP) (Terpe, 2003). Nos dias de hoje, os tags de polihistidina são os mais utilizados na purificação de proteínas recombinantes uma vez que são pequenos (cerca de 3-8 histidinas) e quase nunca interferem com a função ou atividade proteica. Os tags de HIS apresentam uma elevada afinidade para principalmente iões de níquel, e outros iões metálicos imobilizados como iões cobre, zinco ou cobalto (Rubio et al., 2005). A cromatografia por afinidade com metais imobilizados (IMAC) é a técnica mais comum para a purificação de proteínas com tag de polihistidina (Loughran & Walls, 2010). A purificação de proteínas por IMAC foi descrita pela primeira vez por Poroth, em 1975, e baseia-se na formação de um complexo entre um ião metálico e um quelante imobilizado que atua de acordo com a interação dos resíduos de histidina (Poroth et al., 1975). A proteína com o tag HIS vai ligar-se de forma seletiva ao ião metálico, enquanto que outras proteínas não se ligam ou ligam-se de forma fraca, sendo removidas facilmente. As proteínas com caudas de polihistidina apresentam uma maior afinidade para os iões níquel (Ni2+) mas a intensidade da ligação pode ser afetada pela extensão do tag, pela sua posição na extremidade N’ ou C’ e pelo pH dos tampões de ligação e eluição utilizados (Hage, 1999). Esta técnica de purificação permite a purificação com elevada rapidez e com um enorme grau de pureza de proteínas com diferentes características, com um elevado rendimento e de forma económica (Arnau et al., 2006).