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A purificação do antigénio recombinante MIC3 foi realizada através de cromatografia por afinidade IMAC (do inglês, Immobilized Metal-ion Affinity Chromatography), criado de forma a purificar proteínas com afinidade para iões metálicos, como é o caso das proteínas marcadas com tags de histidina.

2.5.1 Escolha e preparação da resina para purificação por IMAC

As proteínas marcadas com tags de polihistidinas apresentam, geralmente, maior afinidade para os iões metálicos bivalentes, como é o caso do níquel (Ni2+) (Hage, 1999). Por essa mesma razão, a purificação do antigénio recombinante foi realizada utilizando o kit Ni Sepharose™ 6 Fast Flow da GE Healthcare®_{. Este método de purificação requer a}

utilização de tampões apropriados para a ligação à resina e posterior eluição do antigénio recombinante (quadro 13).

Tampão Composição química Função

Tampão de Ligação

25 mM de Fosfato de Sódio; 500 mM de Cloreto de Sódio; 10

mM de Imidazole

Ligação do antigénio recombinante MIC3 à resina

Tampão de Eluição

25 mM de Fosfato de Sódio; 500 mM de Cloreto de Sódio; 500

mM de Imidazole

Eluição da proteína recombinante previamente ligada

aos iões de níquel presentes na coluna Tampão de Remoção de Níquel 20 mM de Fosfato de Sódio; 0,5 mM de Cloreto de Sódio; 50 mM de EDTA; pH 7,4

Remoção dos iões de níquel da resina e, consequentemente de todas as moléculas a eles ligadas

Tampão de Regeneração da Resina

0,1 M de Sulfato de Níquel Introdução dos iões de níquel na resina

A resina foi preparada de acordo com as indicações do fabricante. Num passo inicial, a resina foi homogeneizada e transferiram-se 2 mL de resina para um tubo falcon de 15 mL, o qual sofreu centrifugação a 5000 g durante 5 minutos. O sobrenadante foi descartado e adicionaram-se 5 mL de água desionizada ao tubo falcon. O tubo sofreu agitação orbital durante 3 minutos e posteriormente foi centrifugado nas condições Quadro 13 - Composição e função dos diferentes tampões utilizados no processo de purificação do antigénio recombinante MIC3 por IMAC com o kit Ni Sepharose™ 6 Fast

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descritas anteriormente, de forma a sedimentar a resina. O sobrenadante foi novamente removido e foram adicionados 5 mL de tampão de ligação ao tubo, homogeneizando o tampão com a resina antes de proceder a uma nova centrifugação. Descartou-se uma vez mais o sobrenadante e constituiu-se a uma solução de 50% de resina em volume adequado de tampão de ligação.

Nesta técnica utilizou-se uma coluna HiTrapTM da GE Healthcare®, cujo filtro sofreu uma lavagem prévia com etanol a 20%, seguida com uma lavagem com água desionizada.

2.5.2 Preparação da amostra para a purificação do antigénio recombinante MIC3

De forma a ser utilizada num processo de IMAC, a cultura bacteriana estimulada com IPTG foi previamente preparada. O sedimento resultante das culturas de 10 mL de E. coli BL21 XJB (DE3) e RIPL(DE3) estimuladas, foi ressuspendido em 5 mL de tampão de lise, 10 µL de PMSF 200 mM, 10 µL de CaCl2 1M e 20 µL de DNAse 5 U/ µL. A

amostra foi congelada a -20ºC, descongelada logo a seguir, e foi adicionado à amostra mais 2 mL de tampão de lise e voltou a repetir-se o processo de congelação e de descongelação. Após a descongelação, adicionou-se 1 mL de tampão de lise e centrifugou-se a amostra a 5000 g , durante 15 minutos. O sobrenadante resultante da centrifugação foi guardado e o sedimento foi ressuspendido em 2 mL de tampão de lise, tendo sofrido nova centrifugação nas mesmas condições anteriores. O sobrenadante foi novamento guardado e o pellet foi ressuspendido em 6 mL de ureia 8 M, sendo a amostra centrifugada novamente e o sobrenadante foi guardado.

Com o intuito de otimizar a técnica de purificação por IMAC, fizeram-se ensaios de purificação com diferentes tampões, de forma a atestar qual tampão permitia uma melhor purificação e maior quantidade de proteína recombinante purificada. Nestes ensaios foram testados cinco tampões distintos relativamente ao valor de pH e pelo seu componente de base: Fosfato de Sódio (pH 7.5), HEPES (pH 7.5 e 8.0) e Tris-HCl (pH 8.0 e 8.5). A composição química dos tampões em teste encontra-se descrita no anexo VI.

2.5.3 Purificação do antigénio recombinante MIC3 por IMAC

O procedimento de purificação foi adaptado das recomendações da GE Healthcare® _{relativamente ao kit da resina Ni Sepharose™ 6 Fast Flow, tendo sofrido}

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ligeiros ajustes para otimização da técnica IMAC, de forma a ser possível obter uma maior quantidade de antigénio recombinante purificado. Neste passo, foram purificados tanto o sobrenadante resultante do tampão de lise como o sobrenadante resultante da ureia, em duas purificações IMAC.

Procedimento de purificação: a resina foi lavada inicialmente com 25 mL de

tampão de ligação. Adicionou-se tampão de ligação à amostra, numa concentração 1:3 (adição de 500 µL de tampão de ligação por 1,5 mL de amostra), e passou-se a amostra pela coluna, recolhendo os eluídos resultantes para tubos eppendorf de 1,5 mL, em fracções de 1 mL. A amostra foi aplicada duas vezes consecutivas na coluna. De seguida eluiu-se a proteína recombinante ligada aos iões de níquel com 20 mL de tampão de eluição e recolheu-se todo o eluído novamente em frações de 1 mL. Por fim, foi feita uma eluição dos iões de níquel da resina e de todas as moléculas a eles ligadas através da adição de 10 mL de tampão de remoção de níquel, tendo o produto da eluição sido recuperado para dez tubos eppendorf, em fracções de 1 mL. Terminado o processo de purificação, as frações foram analisadas por leitura da absorvância (ABS) a 280 nm no equipamento Nanodrop 1000 da Thermo Scientific®, por ELISA a 405 nm (ver secção 2.5.4) e por SDS-PAGE, após concentração das fracções, para avaliação da quantidade de proteína eluída.

2.5.4 Técnica de ELISA para detecção de proteína recombinante eluída após purificação por IMAC

Numa placa de ELISA Greiner® com poços transparentes de fundo raso, adicionaram-se 50 µL de todas as frações de 1 mL recolhidas durante o processo de purificação do antigénio recombinante, em diferentes poços. Foram realizados dois ensaios de ELISA, um para a purificação dos eluídos da amostra de sobrenadante recolhido após tratamento com tampão de lise e outro para os eluídos da amostra tratada com ureia 8 M. Os produtos de eluição ficaram a adsorver à placa durante 1 hora a 37ºC. Findo o tempo de incubação, as placas foram lavadas duas vezes com PBS-Tween 1X (PBS 1X com 0,05% de Tween-20) e uma vez com água. Adicionou-se a cada poço das placas 40 µL de anticorpo anti-histidina conjugado com peroxidase (Sigma-Aldrich®, A7058), diluído a 1:3000 em PBS-Tween 1X (PBS-T) e incubaram-se as placas durante

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30 minutos a 37ºC. Após a incubação, as placas foram novamente lavadas três vezes com PBS-T e uma vez com água e, logo de seguida, fez-se a revelação dos resultados através da adição a cada poço de 40 µL de substrato ABTS (ácido 3-etilbenzotiazolina-6- sulfónico), preparado numa concentração final de 0,2 mg/mL em tampão de citrato de sódio 0,1M, pH 4.2, com 1 µL/mL em peróxido de hidrogénio 30%. O substrato ficou em contacto com os poços a 37ºC, até ao surgimento de cor e, posteriormente, foi feita a leitura dos resultados a 405 nm, no leitor de microplacas Infinite® 200 Pro da Tecan®.

2.5.5 Concentração das frações de eluição com Etanol a 100%

Todas as frações que apresentaram cor na técnica de ELISA foram concentradas posteriormente utilizando a precipitação com etanol a 100%. A cada mililitro de fração foi adicionado 1 mL de etanol a 100% e 10 µL de acetato de potássio 3 M. As amostras foram incubadas durante 30 minutos em gelo e, findo o tempo de incubação, sofreram centrifugação a 15400 g durante 15 minutos. Após a centrifugação, o sobrenadante foi descartado e foi adicionado 1 mL de isopropanol a 70% de forma a remover possíveis sais presentes. A amostra foi novamente centrifugada nas condições anteriores. Seguidamente, descartou-se novamente o sobrenadante e adicionou-se 1 mL de etanol a 100%, voltando a centrifugar os tubos eppendorf. Após descartar o sobrenadante, os tubos eppendorf secaram ao ar e adicionou-se 20 mL de tampão Laemmli 2X (60 mM Tris-HCl pH 6,8; 10% Glicerol; 2% SDS; 5% β-mercaptoetanol; 0,025% azul de bromofenol). Ferveram-se as amostras durante 10 minutos e procedeu-se à realização de um gel de SDS-Page para avaliar a purificação.