F ORHANDLINGSPROSESSEN

O desequilíbrio nucleotídico que ocorre durante a fase de replicação celular foi relacionado no passado como um possível evento que poderia ocasionar o fenômeno da hipermutação. Durante a replicação do DNA celular existe aumento das concentrações de dTTP em relação a dCTP e atribuiu-se a esse viés a probabilidade de inserção da base T em detrimento da base C na fita de cDNA viral a qual é finalmente fixada na fita de polaridade positiva na forma de mutações G  A, caracterizando a hipermutação. Além disso, sempre era observado que o acúmulo de elevado número de mutações G  A não era acompanhado do aumento de outras mutações. Quando experimentos tentaram reproduzir as condições de hipermutação, ocorreu perda da especificidade das substituições G  A, reforçando a hipótese de que a hipermutação era um fenômeno bioquímico específico e independente da alta taxa de erro da enzima transcriptase reversa viral. Mais recentemente este fenômeno foi atribuído às APOBECs celulares.

Embora a hipermutação causada pela APOBEC3G seja uma barreira natural contra retrovírus, não é o suficiente para impedir a infecção pelo HIV-1. Atualmente é conhecido que as APOBECs podem incrementar a diversificação do vírus quando a hipermutação G-A é ineficiente para neutralizar todos os genomas virais no organismo hospedeiro (Jern et al., 2009; Sadler et al., 2010).

Entende-se que a ação das APOBECs no nível celular pode ocasionar perda do conteúdo informacional genômico do HIV-1 através da geração de genomas hipermutados. Por outro lado, essa mesma ação pode contribuir para o surgimento de mutações que conferem ao vírus resistência aos anti-retrovirais (Jern et al., 2009). O mecanismo de hipermutação causado pela APOBEC3G e a atividade de ubiquitinação do gene vif do HIV-1 caracterizam-se como um processo de co-evolução entre retrovírus e células de primatas. Neste sentido, o presente estudo reuniu experimentos cujo objetivo foi avaliar a influência da composição gênica de indivíduos e da diversidade viral na epidemia do HIV-1.

Polimorfismos em loci do gene A3G. Os resultados mostraram que os 7 polimorfismos no

gene da A3G, descritos como prevalentes em estudos anteriores, estão presentes na população brasileira. Observou-se que as frequências genotípicas em locus específicos do gene apobec3g

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em brasileiros é semelhante às frequências observadas em europeus. Em adição, a substituição H186R, que foi associada a acelerada progressão para AIDS em afro-americanos, tem baixa frequência na população brasileira (2%) e nenhuma correlação com valores de carga viral ou células T CD4+.

A ocorrência de polimorfismos em uma população pode ser influenciada por sua ancestralidade, e a população brasileira é uma das mais heterogêneas do mundo. Até o início do século 19, a população brasileira foi composta por portugueses, nativos ameríndios e africanos (trazidos como escravos para trabalhar em plantações de cana). Entre 1820 e 1964, diferentes ondas de imigração ocorreram no Brasil, e os principais grupos imigrantes foram: portugueses, espanhóis, italianos, japoneses e alemães, que colonizaram principalmente as regiões Sul e Sudeste do país. É conhecido que houve miscigenação desses grupos étnicos em diferentes níveis e, portanto, a composição genética da população brasileira não é heterogênea.

Estudos mostraram que existe um forte viés genético devido à predominante miscigenação entre homens europeus com mulheres ameríndias ou africanas (Sans, 2000; Wang et al., 2008). O resultados apresentados no presente trabalho está de acordo com estudos prévios de outros genes (Gaspar et al., 2001; Lins et al., 2009), que também indicaram o forte impacto que a colonização européia exerceu na composição genética da população brasileira. Nossos resultados confirmam esse viés, pois a freqüências gênicas dos loci aqui analisados são semelhantes às freqüências observadas em europeus e diferem das freqüências encontradas entre africanos (Bizinoto et al., 2010).

As amostras que compuseram a casuística são de invidivíduos que viviam na cidade de São Paulo, entre 1989 e 2006. De acordo com o IBGE (Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística), São Paulo tem uma população estimada de mais de 11.000.000 de pessoas vivendo na área urbana, além de ser um centro econômico e cultural que atrai pessoas de outras cidades e de países vizinhos; isso torna a cidade a mais etnicamente diversa do Brasil. Estima-se que mais de 730.000 indivíduos são infectados pelo HIV-1 no Brasil, e 46% estão localizados no estado de São Paulo (http://www.aids.gov.br). Todas as linhagens virais já identificadas na população brasileira já foram detectadas na cidade de São Paulo (http://www.hiv.lanl.gov/), lembrando que a epidemia do HIV no Brasil é peculiar devido à diversidade de subtipos e recombinantes, e a presença de variantes do subtipo B que foram relacionados à progressão lenta para a doença (Kuiken et al., 1992; Morgado et al., 1994; Ndung'u et al., 2000; Santoro-Lopes et al., 2000; Sanabani et al., 2006; Leal et al., 2008).

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As freqüências genotípicas dos SNPs também foram utilizadas para avaliar o equilíbrio de Hardy-Weinberg (HW) no gene da A3G. O modelo de HW diz que as freqüências alélicas permanecem constantes ao longo do tempo (geração após geração) em grandes populações idealizadas, onde: exista reprodução aleatória, não existam mutações, ausência de seleção, a população não é afetada pela deriva genética e não há migração. Embora o esperado fosse que a população desviasse desse equilíbrio, devido à contribuição de grupos étnicos não-europeus para a composição genética da população brasileira, os resultados mostraram que todo o loci está em equilíbrio segundo a lei de Hardy-Weinberg, com excessão do lócus 199.

Análises do desequilíbrio de ligação (linkage desiquilibrium, ou LD) revelaram não independência na segregação dos alelos, visto que todos os pares de lócus analisados mostraram forte ligação no gene apobec3g, provavelmente devido as suas localizações genômicas próximas.

Polimorfismos e dados clínicos. Embora a composição genética de um indivíduo seja capaz

de influenciar a suscetibilidade ao vírus e progressão da doença, a maioria dos SNPs da A3G não teve efeito significante no estado clínico da população avaliada. A única exceção foi uma fraca correlação do polimorfismo -571 (rs5757463) com valores de células T CD4+. Não está claro como esse SNP poderia influenciar a atividade da A3G, já que está localizado em uma região não traduzida do gene. Uma explicação plausível seria o fato de esse SNP estar localizado em uma região responsável por regular a transcrição dessa proteína. Também é conhecido que há mudanças na expressão da A3G durante a infecção pelo HIV-1 (Vazquez- Perez et al., 2009; Reddy et al., 2010) sem, no entanto, ocorrerem mudanças nos valores de carga viral ou células T CD4+ decorrentes de variações nos níveis de RNA mensageiro.

Hipermutação. O presente estudo também reuniu experimentos cujos objetivos foram

correlacionar a presença de hipermutação com níveis de carga viral e células T CD4+ em pacientes infectados pelo HIV-1, obtendo assim, melhor compreensão sobre: os efeitos da hipermutação in vivo sobre as populações do HIV-1; uma possível restrição a nível populacional viral ocasionada pela ação das APOBECs celulares.

A metodologia de classificação das imagens fotodocumentadas em gel de agarose com HA-Yellow fundamentou os resultados obtidos na análise das amostras clínicas. Em

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comparação com estudos anteriores publicados, como o de Pace e colaboradores ou o de Janini e colaboradores, os resultados deste estudo recuperaram seqüências hipermutadas em freqüência elevada (36% em comparação a 43,0% e 9,4%, respectivamente) e pode-se atribuir esses achados ao refinamento da técnica utilizada. Assim sendo, foi detectada hipermutação em 36% das amostras avaliadas porque foi utilizado um critério bastante conservador de análise no que diz respeito ao erro tipo I (falso positivo) considerado durante as análises estatísticas. O rigor da máxima verossimilhança faz com que a probabilidade de falsos positivos seja mínima. Entretanto, este critério pode, eventualmente, desconsiderar algumas amostras positivas.

Um estudo anterior mostrou que genomas hipermutados são capazes de se integrarem de maneira estável nos cromossomos do hospedeiro (Kieffer et al., 2005). Além disso, no mesmo estudo foram apresentadas evidências consistentes de que o fenômeno da hipermutação possivelmente ocorre em todo indivíduo infectado pelo HIV-1, embora os clones hipermutados não sejam dominantes no conjunto de partículas virais encontradas no paciente, sendo pouco mais que 9% neste estudo e aproximadamente 20% no estudo de Gandhi e colaboradores (Gandhi et al., 2008). Mesmo considerando que o índice recuperado de partículas virais hipermutadas foi elevado no estudo aqui realizado em relação a outros estudos, suspeita-se de que este evento deva ser ainda mais prevalente do que se consegue detectar. Deve-se considerar ainda que muitas sequências hipermutadas digeridas por endonucleases apurínicas/apirimidinicas são perdidas e não detectadas (Yang et al., 2007). É plausível considerar que a hipermutação, de fato, possa ocorrer em todos os pacientes infectados pelo HIV-1, e que as populações hipermutadas são inviáveis.

A hipermutação é claramente capaz de limitar a

proliferação do vírus devido à introdução de códons de parada e perda de fases de leitura da

sequência, o que pode ser diretamente letal ao vírus.

Em contrapartida, já foi demonstrado que baixos níveis de mutagênese induzida pela APOBEC3G contribuem para a evolução do gene vif, causando maior variabilidade em regiões que são sítios preferenciais de ação das APOBECs. Embora as mutações introduzidas pela transcriptase reversa viral tenham maior importância na evolução de variantes resistentes aos medicamentos, o efeito das APOBECs nesse contexto é considerável (Jern et al., 2009).

Outro aspecto importante da hipermutação é sua relação com o estado clínico dos indivíduos infectados pelo HIV, o que pode refletir o efeito dessa mutagênese, seja a favor da

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diversificação viral ou da inviabilização das sequências. Já foi descrito que valores de células T CD4+ mais elevados foram encontrados em indivíduos com provírus hipermutados quando comparados a indivíduos sem hipermutação (Land et al., 2008). No entanto, aqui não encontramos qualquer relação entre hipermutação e progressão da doença, utilizando como parâmetro clínico os valores de carga viral e células T CD4+.

Epistasia e Diversidade do Vif. Um achado importante do presente trabalho foi o efeito

epistático detectado em cinco pares de códons do gene vif (78-154, 85-154, 101-157, 105-157 e 105-176) e suas associações com valores de células T CD4+. Um estudo prévio identificou que, quando há mutação nas posições 105 a 107 da proteína Vif, com troca dos aminoácidos QLI para AAV, há diminuição de 2% na infectividade de isolados selvagens do HIV (Simon et al., 1999). Os aminoácidos localizados entre as posições 154 e 157 do Vif compreendem a BC-Box, que é a região de ligação às proteínas celulares Elongina B e C que mediarão a degradação da A3G através da ubiquitinação e degradação via proteassomo. Notavelmente, os códons 154 e 156 estão localizados na alfa-hélice da região BC-Box, o que implica a possibilidade de que certos aminoácidos dessa região possam afetar a interação com o complexo celular Elongina B e C interferindo, portanto, na capacidade do Vif degradar a APOBEC3G.

A epistasia foi investigada adicionalmente usando um modelo gráfico Bayesiano que investiga a co-evolucao de aminoácidos em sequencias ancestrais inferidos em filogenias. Os resultados indicaram que os sítios 80-83, 80-86 e 83-144 do gene vif estão co-evoluindo. Curiosamente, apesar de os dois métodos não indicarem os mesmos sítios, estes resultados corroboram a identificação de uma região entre os códons 78 a 86 do gene vif que possui muitos sítios epistáticos em co-evolução com códons localizado na BC-Box.

Na epidemia do HIV no Brasil, com uma diversidade de subtipos e recombinantes, a presença de variantes do subtipo B foram relacionados à progressão lenta para a doença (Kuiken et al., 1992; Morgado et al., 1994; Ndung'u et al., 2000; Santoro-Lopes et al., 2000; Sanabani et al., 2006; Leal et al., 2008). Entretanto, a comparação entre aminoácidos que compoem as sequências de vif mostraram uma variabilidade limitada, mesmo nas regiões YRHHY e DRMR, que são importantes para a degradação da A3G (Russell e Pathak, 2007;

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Chen et al., 2009). O estado conservado do gene vif pode indicar uma limitação evolucionária significativa atuando sobre esse gene viral mesmo entre linhagens distintas.

Foi investigada a possível influência dos polimorfismos da APOBEC3G na estrutura (formação de clados) de árvores filogenéticas enraizadas construídas a partir de sequências do gene vif, e nenhuma associação foi encontrada entre esses polimorfismos e os clados das árvores. Adicionalmente, o método de coalescência indicou que a hipermutação não exerce impacto na taxa estimada de mutações neutras. É possível que outros polimorfismos, localizados em pontos de interação entre o Vif e a APOBEC3G, possam influenciar a estrutura das árvores.

Sítios sob pressão seletiva foram detectados distribuídos ao longo de todo o gene vif. Entretanto, foram mais concentrados na região entre os motivos WKSLVK e YRHHY, que especificamente se ligam e neutralizam a A3G. Outros sítios sob pressão seletiva foram encontrados na região BC-Box (reponsável pela interação com as proteínas celulares Elongina B e C) e também na região de interação com a proteína Culina 5 (Cullin-Box), ambas envolvidas na degradação da A3G.

A evolução adaptativa do gene vif deve-se, em grande parte, à vigilância do sistema imune do hospedeiro contra proteínas virais. Entretanto, existem vários sítios de pressão seletiva que foram identificados fora das regiões onde estão localizados os epítopos de linfócitos T citotóxicos. Além disso, extensos intervalos de sequências de vif, em que epítopos de linfócitos T citotóxicos foram virtualmente identificados, não mostraram qualquer indício de pressão seletiva. Um estudo demonstrou que os motivos WKSLVK e YRHHY são essenciais para a habilidade do Vif em se ligar à A3G (Chen et al., 2009). Por essas razões, a seleção positiva observada em códons do gene vif pode igualmente ser atribuída à resposta adaptavia para aperfeiçoar o reconhecimento e neutralização da A3G pelo HIV-1. Outra evidência do papel fundamental de adaptação dos sítios na região entre os motivos WKSLVK e YRHHY é a alta freqüência de recombinação.

Ressalta-se que existe um paralelo entre a evolução adaptativa observada nos genes vif e nef do HIV-1. Aqui foi demostrado que o vif está sob seleção purificadora e, talvez, esse padrão seja necessário para preservar a sua função biológica durante o ciclo de replicação viral. Da mesma forma, Nef também tem sua atividade biológica e está semelhantemente em seleção purificadora (Walker et al., 2007; Cavalieri et al., 2009). No entanto, Nef é uma

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proteína multifuncional, e esta característica pode ser observada pela sua plasticidade, representada por polimorfismos e variações no comprimento da sequência de aminoácidos, que podem ser detectados em amostras populacionais, em culturas virais ou até mesmo em um único indivíduo. Em contrapartida, aqui foi dectado que o gene vif é conservado até mesmo entre diferentes linhagens do HIV-1 (ou seja, o subtipo A, subtipo B, o subtipo F, o subtipo C e recombinantes BF).

Novos estudos baseados na comparação dos padrões evolucionários de genes do HIV- 1 seriam benéficos e elucidariam as estratégicas terapêuticas. Uma nova tentativa de análise foi realizada a fim de estabelecer a influência do estado clínico dos indivíduos no regime seletivo do HIV-1. Em um estudo realizado a nível populacional foi observado que valores de células T CD4+ maiores que 200 células/μl foram associados ao aumento da taxa dN/dS do gene vif de isolados do subtipo B do HIV-1 (Diaz et al., 2008). Por essa razão, avaliamos a intensidade da seleção positiva no gene vif dividindo os dados em três categorias de acordo com os valores de células T CD4+ (>200, 200-400 e >400). Não foi encontrada diferença significativa nas médias dN/dS entre os grupos analisados (3.65, 3.85 e 3.09 respectivamente).

Do mesmo modo, sequências hipermutadas foram avaliadas no intuito de identificar distintos padrões seletivos. Novamente, não houve diferença entre sequências hipermutadas e não hipermutadas; os sítios de seleção positiva foram praticamente os mesmos nos dois grupos. Deve-se considerar que sequências hipermutadas são, em sua maioria, inviáveis, e por não se replicarem não geram descendentes e nem são alvo de pressão seletiva. Concluiu-se com os resultados que os valores de células T CD4+ e hipermutação não tiveram influência na taxa de evolução adaptativa do gene vif.

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