Efecto de la hipermutación sobre la adaptación y evolución bacteriana en

A lo largo de la última década, varios modelos teóricos, in vitro e in vivo han demostrado que bajo circunstancias particulares como la exposición a nuevos ambientes o condiciones de estrés, se seleccionan cepas hipermutadoras en las poblaciones bacterianas. Este fenotipo hipermutador puede conferir una ventaja evolutiva durante la exposición de la bacteria a estos ambientes nuevos,

cambiantes o de estrés, incrementando la tasa de mutaciones adaptativas (Denamur y col., 2006; Giraud y col., 2001; Mao y col., 1997; Sniegowski y col., 1997; Taddei y col., 1997). Varios modelos experimentales han demostrado que la adaptación al sistema inmune del huésped (Nilsson y col., 2004), a los tratamientos antibióticos (Maciá y col., 2006), o a la parasitación por virus (Pal y col., 2007), está acelerada en los fenotipos hipermutadores.

La asociación de la hipermutación con uno de los más relevantes tipos de mutaciones adaptativas que favorece la persistencia en las infecciones crónicas, el desarrollo de resistencia antibiótica, ha sido claramente documentado (Ciofu y col., 2005; Maciá y col., 2005; Oliver y col., 2000). Una alta prevalencia de cepas hipermutadoras, asociado con la resistencia antibiótica, ha sido también documentada para otros patógenos relevantes que infectan crónicamente a pacientes FQ como son Staphylococcus aureus y Haemophilus influenzae (Prunier y col., 2003; Román y col., 2004; Watson y col., 2004). Sin embargo, hasta el momento, no se ha demostrado una clara relación entre la hipermutación y la persistencia o adaptación genética en las infecciones crónicas.

Varios modelos in vivo, aunque ninguno realizado con Pseudomonas, han demostrado que la hipermutación debe favorecer la adaptación y persistencia de los patógenos bacterianos. Estos trabajos, realizados con cepas deficientes en el sistema MMR, demostraron que la hipermutación, inicialmente, debe ser beneficiosa porque permite la adaptación más rápida de E. coli en un modelo de colonización intestinal (Giraud y col., 2001) y su persistencia en infecciones del tracto urinario (Labat y col., 2005), así como la adaptación de Salmonella al sistema reticuloendotelial (Nilsson y col., 2004). Los resultados de nuestro modelo de colonización orofaríngea en ratones FQ aporta datos relevantes en esta misma dirección. Aunque la cepa deficiente en mutS mostró un potencial reducido para la colonización orofaríngea inicial en los ratones FQ comparado con la wild-type, fue invariablemente seleccionada tras un largo periodo de colonización en ausencia de presión antibiótica, sugiriendo claramente que la hipermutación favorece la selección de mutaciones adaptativas requeridas para la persistencia a largo plazo.

Sin embargo, y de acuerdo con los experimentos de competición comentados

anteriormente, las cepas persistentes deficientes en mutS no mostraron una capacidad incrementada para la colonización orofaríngea posterior de nuevos ratones FQ, más bien al contrario, ya que todas las estirpes adaptadas fueron desplazadas por la cepa wild-type durante la colonización orofaríngea inicial de nuevos ratones FQ. Estos resultados, en concordancia con aquellos recogidos en estudios con cepas clínicas de pacientes FQ (Ciofu y col., 2005; Oliver y col., 2000), sugieren que las cepas hipermutadoras se seleccionan como consecuencia de la adaptación al ambiente del tracto respiratorio de los pacientes FQ pero además que su capacidad para la colonización eficiente de ambientes secundarios (incluyendo otros pacientes FQ) estaría reducida. Esto mismo se observa también en los trabajos de Hogardt y col. (2007) y Montanari y col. (2007) donde se pone de manifiesto el coste biológico que la adaptación de estas cepas supone para las células reduciendo así su viabilidad, y la capacidad de sobrevivir libremente, y como consecuencia, su transmisibilidad. En concordancia con estos datos, en un estudio reciente se observó que dos clones de P. aeruginosa no hipermutadores predominantes a lo largo de 20 años en una población de pacientes FQ, eran perfectamente transmisibles entre pacientes, demostrando, además con ello, que rasgos tan comúnmente relacionados con el establecimiento de la infección crónica por P. aeruginosa como el fenotipo mucoide o la producción de factores de virulencia, tal vez, no estén tan relacionados con la transmisibilidad de los clones (Jelsbak y col., 2007).

Aunque la colonización orofaríngea persistente por PAO∆mutS se documentó en un 20% de los ratones FQ, no fuimos capaces de documentar signos claros de un aumento progresivo de la colonización del tracto respiratorio inferior y de la posterior respuesta inflamatoria patológica durante los seis meses estudiados. Las variantes mucosas, marcadores típicos de colonización respiratoria crónica por P.

aeruginosa en pacientes FQ (Govan y Deretic 1996) tampoco fueron detectadas, aunque otra variante fenotípica frecuente en la FQ, las small colony variants (SCV) (Häuβler y col., 1999) fueron seleccionadas frecuentemente a partir de la cepa PAO∆mutS (datos no mostrados).

En general estos resultados sugieren que durante el marco de tiempo, de seis

meses, estudiado (que no puede ser mucho más alto con este modelo debido a la esperanza de vida natural de los ratones) sólo se alcanzaron las primeras etapas del complejo proceso de colonización crónica respiratoria. Por otra parte, estas observaciones hacen este modelo bastante compatible con la historia natural del proceso en pacientes FQ, en los que los marcadores de colonización crónica aparecen típicamente varios meses después de la colonización inicial (Gibson y col., 2003). El proceso respiratorio crónico por si mismo (pero no su historia natural) puede ciertamente ser más eficientemente reproducido y estudiado por la inoculación directa en el tracto respiratorio de ratones FQ (o incluso no-FQ) de cepas naturales (y por lo tanto adaptadas) de P. aeruginosa aisladas de pacientes FQ crónicamente infectados, particularmente aquellas cepas que muestran el fenotipo mucoide característico (Hoffmann y col., 2005). Nosotros intencionadamente usamos la cepa de P. aeruginosa no adaptada PAO1 (y su derivada deficiente en mutS), que es la primera cepa de referencia completamente secuenciada y ampliamente utilizada (Stover y col., 2000) (aislada de una infección de herida hace unos 50 años), y la exposición en el agua de bebida (en lugar de la inoculación directa) con el objetivo de reproducir el proceso de adaptación natural en la colonización crónica respiratoria en la FQ.

3. Hipermutación en poblaciones bacterianas naturales

La frecuencia de cepas hipermutadoras que se han encontrado en la naturaleza ha resultado ser mucho mayor de lo esperado. En los trabajos iniciales la hipermutación se asoció a la patogenicidad al observar que la incidencia de cepas hipermutadoras era mayor (alrededor al 1%) en aislados patógenos de E. coli y Salmonella. enterica que en aislados no patógenos (Le Clerc y col., 1996). Sin embargo, poco después se encontró una frecuencia de cepas hipermutadoras similar en aislados comensales y patógenos de E. coli (Matic y col., 1997). A lo largo de los años, las cepas hipermutadoras han sido descritas en diversas poblaciones bacterianas naturales con presencia variable (Baquero y col., 2004;

Le Clerc y col., 1996; Matic y col., 1997), sin embargo, parecen estar sobrerepresentadas en las infecciones crónicas, mientras que son poco frecuentes en las infecciones con procesos agudos. Oliver y col. (2000) proporcionaron la primera evidencia de la selección del fenotipo hipermutador en poblaciones naturales de P. aeruginosa mediante el estudio de la infección pulmonar crónica por este microorganismo en pacientes FQ. La prevalencia de cepas hipermutadoras encontradas en estos pacientes resultó ser, con diferencia, la mayor descrita jamás en la naturaleza hasta ese momento. Se encontró que el 37% de los pacientes FQ estaban colonizados por cepas hipermutadoras, mientras que el fenotipo hipermutador no aparecía en pacientes no FQ que presentaban infección aguda por P. aeruginosa. Estudios posteriores realizados por Ciofu y col., (2005) y Montanari y col., (2007) han confirmado el alto porcentaje de pacientes FQ que se colonizan o infectan con cepas hipermutadoras de P.

aeruginosa (54,4% y 60%, respectivamente). Sin embargo, no se trata de un hecho exclusivo de la FQ, ya que se ha demostrado que ocurre lo mismo en otras enfermedades respiratorias crónicas como son las bronquiectasias o el EPOC (Maciá y col., 2005). Es, por tanto, un rasgo diferencial de las infecciones pulmonares crónicas por P. aeruginosa, la alta prevalencia (30-60%) de cepas hipermutadoras, en contraste con lo que se observa en procesos agudos (< 1%).

Por ejemplo, Gutiérrez y col. (2004) encontraron un solo aislado hipermutador de un total de 103 pacientes de la UCI con infecciones por P.aeruginosa. Además, se ha observado que la relación entre hipermutación e infección crónica no es exclusiva de P. aeruginosa, existen trabajos donde se ha encontrado un mayor prevalencia (14%) de cepas hipermutadoras de Staphylococcus aureus y Haemophilus influenzae en pacientes FQ que en pacientes con otro tipo de infecciones (1%) (Prunier y col, 2003; Román y col., 2004).

Nuestros resultados, donde se analiza por primera vez una colección de aislados de pacientes FQ norteamericana (Smith y col., 2006), encajan bien con los resultados previos. Encontramos que el 31% de los 29 pacientes estudiados estaban colonizados por cepas hipermutadoras. Estos trabajos demuestran que el fenotipo hipermutador se selecciona, principalmente, en procesos crónicos y que,

por lo tanto, debe jugar un importante papel en la adaptación bacteriana para la persistencia a largo plazo. Se ha demostrado, sin embargo, que la prevalencia de cepas hipermutadoras en fases tempranas de la infección por P. aeruginosa en pacientes FQ así como en el ambiente, es mayor de lo que cabía esperar (Kenna y col., 2007) sugiriendo que el pulmón FQ no debe ser el único factor que influye en la aparición de las cepas hipermutadoras en estos pacientes. Nuestros datos muestran que la mayoría de las líneas hipermutadoras emergieron durante el desarrollo de la IRC a partir de cepas clonales (24,1%), aunque en 2 de los pacientes (6,9%) los mutantes se detectaron en los primeros aislados, obtenidos al inicio de la infección pulmonar. Estos datos sugieren que, en algunos casos, los pacientes FQ se colonizan con cepas que eran previamente hipermutadoras y que pueden encontrarse en el ambiente. Debe destacarse, por lo tanto, el importante papel que juega el pulmón FQ en la selección de estas cepas hipermutadoras, sin embargo, no debe subestimarse la existencia de aislados hipermutadores en el ambiente.