Adaptación fisiológica en la infección crónica: biofilms

Una de las características de las infecciones crónicas bacterianas es el modo de crecimiento en biofilm. Mientras que las infecciones agudas están producidas principalmente por células libres planctónicas de rápido crecimiento capaces de causar daño tisular rápido por invasión y citotoxicidad, las infecciones crónicas están producidas por células que crecen en comunidades multicelulares bien estructuradas y organizadas embebidas en una matriz polimérica que producen ellas mismas y que les permite adherirse a superficies inertes o vivas (Costerton y col., 1999). Sin embargo, los biofilms pueden jugar también un papel indirecto importante en las infecciones agudas nosocomiales gracias a la formación de biofilms en las superficies inertes de tubos endotraqueales o catéteres que generalmente preceden a una neumonía asociada a ventilación mecánica o a infecciones del tracto urinario en pacientes sondados.

La transición de células planctónicas al crecimiento en biofilm, que conlleva cambios fisiológicos profundos, se consigue a través de un complejo proceso secuencial que incluye al menos 5 pasos bien diferenciados caracterizados usando modelos in vitro (Sauer y col., 2002):

i) Unión reversible. Las células planctónicas contactan con la superficie y se van fijando e ella. En este paso se requiere la expresión del flagelo.

ii) Unión irreversible. La motilidad cesa, las células comienzan a agregarse en una unión que ya no será reversible.

iii) Maduración I. Los agregados de células van formando capas progresivamente (de más de 10 μm de grosor), se observan grandes

diferencias en el patrón de expresión de proteínas comparado con las células planctónicas.

iv) Maduración II. Los agregados de células alcanzan el máximo grosor (alrededor de 100 μm), la mayoría de las células son segregadas dentro de los agregados celulares, estos agregados son desplazados de la superficie, y se observan grandes diferencias en los patrones de expresión de proteínas (más

crecimiento planctónico).

v) Dispersión. Algunas células se convierten en móviles otra vez y se alejan de las partes más internas de los agregados celulares, recuperando un perfil de expresión de proteínas similar al de las células planctónicas.

Se ha visto que la comunicación entre células juega un papel muy importante en el establecimiento de biofilms maduros de Pseudomonas aeruginosa bien estructurados (Davies y col., 1998). Las señales de célula a célula ocurren cuando la población alcanza densidades suficientes (llamado por esta razón quorum sensing), e incluye, al menos, dos sistemas, lasR-lasI y rhlR-rhlI, que han sido comentados anteriormente (apartado 2.3 de virulencia). LasI cataliza las síntesis de una señal extracelular difusible, N-(3-oxodecanoyl)-L-homoserina lactona (C12 -HSL). LasR es un regulador transcripcional que requiere una cantidad suficiente de C12-HSL para activar una serie de genes de virulencia (incluyendo aquellos que codifican para las elastasas LasA y LasB), lasI (mecanismo feedback) y rhlR-rhlI.

RhlI cataliza la síntesis de la molécula señal N-butiril-L-homoserina lactona (C4 -HSL) que se requiere para la activación de la expresión por RhlR de ciertos genes de virulencia (como el ramnolípido) y el factor σ de fase estacionaria RpoS. Se sabe que los sistemas lasR-lasI y rhlR-rhlI se activan en el segundo paso (unión irreversible) y tercer paso (maduración I), respectivamente, del desarrollo del biofilm (Sauer y col., 2002).

Estudios recientes sugieren que la transición de las células planctónicas al crecimiento en biofilm, y por lo tanto la transición del estilo de vida agudo a crónico, está recíprocamente controlado por los reguladores globales de virulencia RetS y LadS (Ventre y col., 2006). Mientras que la señal de RetS se ha visto que activa genes que se requieren para la infección aguda (como las secreciones de tipo III) y que reprime genes que se requieren para la infección crónica (como aquellos que promueven la formación del biofilm), se ha visto que la señal de LadS produce el efecto contrario.

Otro trabajo ha mostrado que P. aeruginosa forma biofilms anaerobios en los pulmones de pacientes infectados crónicamente y estudios in vitro han

demostrado que esta bacteria aerobia paradójicamente prefiere aparentemente la respiración anaerobia en biofilms usando nitratos, nitritos y óxido nitroso como aceptores terminales de electrones (Yoon y col., 2002). Muchos genes son expresados de manera diferente en los biofilms anaerobios vs aerobios haciendo la expresión de la reductasa de óxido nítrico (NO) (que previene la acumulación de este bioproducto tóxico de la respiración anaerobia) y de la proteína de membrana externa OprF factores clave para el modo de crecimiento del biofilm anaerobio.

La trascendencia de los biofilms de P. aeruginosa en la persistencia de las infecciones crónicas recae en su elevada resistencia a los mecanismos de defensa del huésped, incluyendo el aclaramiento mecánico o aquellos mediados por el complemento, anticuerpos, o fagocitos, así como en una mayor tolerancia a los radicales de oxígeno reactivo y su elevada resistencia a la acción de los antimicrobianos, descrita como más de 100 veces mayor que en las células planctónicas. Se ha atribuido a muchos mecanismos la responsabilidad de la resistencia antibiótica del biofilm, que está todavía bajo cierta controversia. Entre ellos, la difusión disminuida (trapping) de los antimicrobianos a través de la matriz exopolimérica actuando sinérgicamente con enzimas inactivantes de antibióticos como las cefalosporinasas cromosómicas, la reducción del ratio de crecimiento simulando una fase estacionaria refractaria a la acción antimicrobiana, la activación de respuestas generalizadas de estrés, o la inducción de genes específicos del biofilm implicados en la resistencia (Bagge y col., 2004; Mah y col., 2001; Whiteley y col., 2001). La organización estructural de los biofilms parece promover la emergencia de poblaciones celulares heterogéneas incluyendo la selección de poblaciones mutantes con resistencia de alto nivel a antibióticos (Boles y col., 2004). En un trabajo muy reciente (Driffield y col., 2008) se comprobó que en el biofilm de P. aeruginosa se produce una menor expresión de enzimas antioxidantes. Por ejemplo, katA, que codifica para la mayor catalasa antioxidante pseudomonal, se expresaba 7,7 veces menos, favoreciendo, así, la acumulación de daños en el ADN provocados por las especies reactivas del oxígeno. Esto, por tanto, podría favorecer la selección directa de poblaciones resistentes a los antibióticos y además favorecer la aparición de hipermutadores

permanentes mediante mutaciones en los genes del sistema MMR, como mutS, que, a su vez, serían otra fuente de aporte de resistencia a los antibióticos.

3.2 Evolución de Pseudomonas aeruginosa en la IPC: mutaciones