Das 3 AGPs em estudo, duas delas, a AGP25 e a AGP27 já tinham linhas mutantes analisadas (dados não publicados), no entanto, um dos membros desta tríade, a AGP26, não apresentava uma eliminação da sua expressão nos mutantes de inserção de T-DNA da NASC (The European Arabidopsis Stock Center), pelo que foi criado um mutante com redução do nível de expressão através da técnica de RNA de interferência (RNAi). Apesar do nível de expressão desta AGP nos tecidos reprodutores ser baixo, era de interesse analisar e caracterizar um mutante para esta glicoproteína para tentar compreender a sua função biológica em Arabidopsis ou mesmo devido à similaridade apresentada por esta AGP com as outras duas glicoproteínas em estudo, como já foi referido anteriormente.
Após a transformação de plantas do tipo selvagem de Arabidopsis a partir de A.
tumefaciens com o constructo 35S:RNAi:AGP26 foi comprovada a presença deste
constructo através da técnica de PCR. Para verificar se o nível da expressão do gene AGP26 se encontrava reduzido nestas plantas foi realizado um RT-qPCR em que
Tecidos AGP25 AGP26 AGP27
Estigma - - - Valvas do pistilo + + - Estilete + + + Saco embrionário - - - Óvulos (caláza) + - + Funículo + - + Tecido de transmissão - - + Septo + - -
foram seleccionadas para estudos posteriores apenas as plantas consideradas mutantes de silenciamento agp26-RNAi.
Um dos estudos mais utilizados quando se pretende caracterizar um fenótipo que possa estar envolvido nos processos de reprodução sexuada de plantas, nomeadamente, nas interacções pólen-pistilo é a coloração dos TPs com o azul de anilina. Este corante permite a coloração da calose presente no grão de pólen e ao longo do TP, e dos tampões de calose que se formam ao longo do seu crescimento. Assim, estudos realizados com esta técnica são extremamente úteis para se perceber o crescimento do TP durante todo o seu percurso pelos tecidos femininos e a sua orientação até chegar ao seu alvo. Esta técnica também pode ser usada para determinar a recetividade do estigma e o período de viabilidade dos óvulos, isto é baseado na premissa de que a deteção de calose nos tecidos do pistilo representa o fim do intervalo de tempo em que o estigma é recetivo e os óvulos são viáveis. Por fim, a coloração dos TPs com azul de anilina também permite verificar se a mutação afeta os tecidos femininos ou masculinos (Dumas e KNox, 1983). Esta técnica foi já utilizada com sucesso no estudo de mutantes de proteínas arabinogalactânicas como moléculas sinal durante o percurso do TP nos tecidos femininos (Coimbra et al., 2010; Pereira et al., 2016b).
Assim, esta técnica foi utilizada para as duas primeiras plantas agp26-RNAi mutantes da geração F0 em que foram realizados cruzamentos recíprocos entre estes mutantes e plantas da variedade selvagem e para as plantas agp26-RNAi (F1) em pistilos autopolinizados. Nos dois casos, verificou-se que os TPs atingem com sucesso o saco embrionário no interior do óvulo e que apenas um tubo polínico alcança o óvulo pelo qual é atraído. Pelo que, não se visualizaram quaisquer defeitos ao nível da orientação ou crescimento dos TPs nestes mutantes.
De modo a verificar se o desenvolvimento dos óvulos e das sementes dos mutantes
agp26-RNAi ocorria de forma normal, estes foram clareados com hidrato de cloral e
observados ao microscópio com DIC. Esta observação permitiu comprovar que todo o desenvolvimento do óvulo desde a formação das células do saco embrionário até à formação do zigoto e endosperma ocorre de forma normal. O mesmo acontece no desenvolvimento da semente com o embrião a desenvolver-se com todas as células e divisões de forma perfeita tal como acontece na variedade selvagem. Pelo que este
gene não terá influência, pelo menos sozinho, ao nível da formação do óvulo e da semente.
Por último, foram analisados vários tipos de possíveis fenótipos relacionados com as síliquas e o conjunto de sementes destes mutantes. O número de sementes com desenvolvimento normal, com desenvolvimento embrionário interrompido no estado pré-globular e com desenvolvimento interrompido no mesmo estado, mas que sofreram dessecação, não apresentaram diferenças significativas entre os mutantes
agp26-RNAi e síliquas da variedade selvagem. Apenas o número de óvulos abortados
numa das plantas mutantes (agp26.3 (F1)) apresenta um número médio significativamente mais elevado de óvulos abortados face às síliquas da variedade selvagem. No entanto, este resultado pode se dever apenas a um crescimento desta planta em condições menos favoráveis que as restantes, visto que esta não corresponde ao mutante de silenciamento mais penetrante. Para além disso, o aspecto visual das síliquas mutantes é similar ao das síliquas da variedade selvagem. Concluindo-se desta análise que não há um fenótipo relativo ao conjunto de sementes com a diminuição da expressão do gene AGP26.
De uma forma geral, as várias plantas mutantes analisadas não revelaram nenhum fenótipo característico pelo que através da análise aqui realizada não foi possível determinar uma função específica para esta AGP. A falta de fenótipo visível pode dever-se, mais uma vez, ao facto de existirem genes com sequências amino acídicas similares, eventualmente, a AGP25 e AGP27. Estas podem executar a sua função quando esta AGP não está presente ou, neste caso, está com um nível de expressão mais reduzido. Como Edelman e Gally (2001) sugeriram, a degeneração genética deve ser considerada para além da redundância, o que significa que processos de desenvolvimento importantes podem ser "cobertos" por várias proteínas, em que qualquer uma pode realizar a mesma tarefa na ausência da outra.