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A avaliação das construções plasmidiais para expressão da RVGP contendo ou não o sinal BiP permitiu observar que o plasmídeo pMTiRVGP (contendo o sinal BiP) apresentou melhores resultados de expressão transiente de RVGP (Figura 11 (A) (B)). Partindo deste raciocínio, e com o intuito de verificar a reprodutibilidade dos resultados obtidos nesse experimento, realizamos um experimento usando essas mesmas condições e incluindo mais dias de amostragem, para identificar até que ponto ainda conseguíamos obter expressão de RVGP.

Na Figura 18 (A), podemos observar que as produções de RVGP atingidas nas primeiras 48 horas de indução foram aproximadamente 2,3 vezes mais baixas que aquelas obtidas no experimento 1s (Figura 11 (A)), no entanto, depois deste ponto as células conseguiram aumentar a expressão de RVGP atingindo valores de 170 ng/107células nas células transfectadas com Cellfectin, 200 ng/107células nas células transfectadas com JetPEI e de 230 ng/107células nas células transfectadas pelo método de fosfato de cálcio. Estes valores representam 43% (1,2 vezes) mais expressão de RVGP nas células transfectadas com Cellfectin e JetPEI e 53% (1,5 vezes) no caso das células transfectadas com fosfato de cálcio.

Neste experimento analisamos a duração e picos da expressão transiente da RVGP em cultivos em suspensão. Desta maneira, observamos na gráfica 18 (A) que o pico de expressão para todos os métodos avaliados foi encontrado às 120 horas após a indução, este fenômeno, diferiu dos resultados encontrados no experimento 1s, no entanto, devido a que nesse caso só tínhamos avaliado até 72 horas de indução, não foi possível uma análise mais conclusiva.

A Figura 18 (B) ilustra a produção volumétrica de RVGP. Podemos observar que, neste experimento conseguimos obter um comportamento crescente de expressão, atingindo valores máximos de aproximadamente 220 ng/mL de RVGP nas células transfectadas com Cellfectin e JetPEI (sendo em média 1,5 vezes mais RVGP que no experimento 1s) e de 270 ng/mL nas células transfectadas com fosfato de cálcio (sendo 1,8 vezes mais RVGP que no experimento 1s). Com este resultado podemos inferir no fato que ainda 5 días após a indução com CuSO4,

podemos obter expressão de RVGP através da transfecção com Cellfectin, JetPEI e fosfato de cálcio.

Na Figura 18 (C) encontramos a cinética de crescimento deste experimento. Podemos ver também uma curva de crescimento das células S2 selvagem. Como observado nos dois

experimentos anteriores, as células atingiram o final da fase exponencial aproximadamente às 72 horas de cultivo e depois desse tempo apresentaram um crescimento discreto atingindo 12×106 cel/mL nas células transfectadas. As células S2 selvagens (sem transfectar) conseguiram atingir 16×106 cel/mL, mas não foi observável uma ampla diferença entre células transfectadas e não. Baseados nestes fatos podemos inferir que o processo de transfecção não afetou o crescimento de células S2, fenômeno que pode ser devido a que o inóculo para começar o experimento (1×106 cel/mL) compreende um número de células suficiente para que o processo não afete a etapa de crescimento exponencial das células.

Estas células foram submetidas à imunoensaios 48 e 72 horas após a indução, conforme descrito em 4.7.1 e analisadas em microscópio de fluorescência. Na Figura 19 é possível notar a marcação com anticorpo anti RVGP nas células transfectadas com JetPEI, Cellfectin e fosfato de cálcio. Como observado em experimentos anteriores podemos notar um baixo número de células expressando RVGP.

Na análise de aminoácidos foi encontrado que os aminoácidos mais consumidos foram Glutamina, Serina, Prolina, Cisteína e Leucina. Na Figura 20 pode ser observado o padrão de consumo ao longo do experimento. Uma suplementação com Cisteína (numa concentração final de 4 mM) foi feita às 48 horas do cultivo, com base no dado do experimento 1s.

Para este experimento a Serina e a Leucina praticamente esgotaram no final do experimento, (144 horas de cultivo) atingindo concentrações de 0,3 mM. A suplementação com Cisteína às 48 horas do cultivo evitou o esgotamento deste aminoácido até o final do experimento Figura 20.

O comportamento de consumo nos diferentes agentes mostrou ser similar em todos os casos Figura 20 (a,b,c). Pode ser observado nesta figura que as concentrações dos aminoácidos no início do experimento se encontravam abaixo dos valores encontrados no experimento 1s Figura 14, o que presume uma degradação do meio de cultivo SF900II.

Figura 18: Células S2 transfectadas com Cellfectin, JetPEI e fosfato de cálcio. As células foram

transfectadas em frasco agitado tipo “schott” de 100mL, com volume de trabalho de 15 mL de meio SF900II e uma densidade celular de 1×106 _{cel/ mL. A concentração de pMTiRVGP usada foi de 15µg e os volumes de}

agentes de transfecção usados foram de 45 µL de Cellfectin, 30 µL ExGen500; e um volume de 50 µL de CaCl2

(2 M) para a formação do precipitado com fosfato de cálcio. As células foram induzidas 24 horas depois da transfecção com CuSO4 (numa concentração final de 700µM). Uma amostra contendo 1×106 cel foi retirada 24,

48 e 72 horas após a induçãoe analisada pelo método de ELISA. As células foram mantidas em incubadora a 28°C com agitação orbital de 100 rpm. Em (A) esta representada a expressão de RVGP (ng/107 _{cel), em (B) está}

representada a expressão volumétrica de RVGP por mL de meio (ng/mL) e em (C) se encontra a concentração celular ao longo do experimento (106 _{cel/mL). As barras correspondem ao desvio padrão das medidas.}

A

C B

Figura 19: Microscopia de imunofluorescência indireta de células S2 transfectadas com pMtiRVGP, 48 e

72 horas após indução com CuSO4. (a) Células S2 transfectadas com JetPEI com 48 horas de indução (b) Células

S2 transfectadas com Cellfectin com 48 horas de indução (c) Células S2 transfectadas com fosfato de cálcio com 48 horas de indução (d) Células S2 transfectadas com JetPEI com 72 horas de indução (e) Células S2 transfectadas com Cellfectin com 72 horas de indução (f) Células S2 transfectadas com fosfato de cálcio com 72 horas de indução.

Figura 20: Consumo de aminoácidos (concentração mM) em células S2 transfectadas com pMtiRVGP,

mantidas em cultivo por 144 horas, a seta preta indica suplementação de Cisteína (numa concentração final de 4mM).(a) Células S2 transfectadas com Cellfectin. (b) Células S2 transfectadas com JetPEI. (c) Células S2 transfectadas com fosfato de cálcio.