Datainnsamling

A suspensão aquosa de Fe3O4NPs foi preparada através da adição de 3 mg de

Fe3O4 em pó a uma solução de tampão fosfato (500 µL) seguindo-se de sonificação

durante 15 min.

2.3.2 Imobilização de nanopartículas funcionalizadas com moléculas catalíticas

Com o objetivo de desenvolver novos materiais de elétrodo catalíticos para a ORR, foi explorada uma nova via de imobilização de nanopartículas modificadas em ouro, com compostos que possuem um macrociclo tetrapirrólico (porfirinas de Co e Fe) e com um macrociclo com um centro cobirinato (derivado da vitamina B12,

B12C10SSC10), utilizando o CS2 como “ponte”, como ilustrado no esquema da figura 2.4.

Foram utilizadas nanopartículas metálicas (Au e Pt) e de óxidos metálicos (Fe3O4 e

MnFe2O4 NPs).

Os procedimentos de modificação de superfícies de ouro foram os seguintes: i) Au (111) /CS2/NPs: imersão do elétrodo de Au (111) durante 16h numa

solução de 500 µL das NPs e em 1mL de CS2 em etanol (1.5 mM);

ii) Au (111) ou Au policristalino/CS2/NPs/porfirina (ou derivado da vitamina B12):

500 L das NPs foram adicionados a 1 mL do composto organometálico em etanol (1 mM) durante 2 min sob sonificação, seguindo-se a adição de 15 L de CS2 em etanol

(0.1 M) e imersão do elétrodo de Au, durante 16h;

iii) Au (111) /porfirina (ou derivado da vitamina B12): o Au foi imerso em 1 mM

do composto organometálico previamente dissolvido em etanol, durante 16 h;

iv) Au (111)/1,6- hexanoditiol/NPs/porfirina: formação da SAM de 1,6- hexanoditiol (1 mM, em etanol) durante 15 min na superfície de ouro; de seguida o elétrodo modificado foi lavado exaustivamente com água e etanol e colocado em contato com uma solução aquosa consistindo em 500 µL de NPs e de 1 mL da solução de porfirina (1 mM) previamente preparado em etanol.

O tempo de reação entre as NPs e os compostos organometálicos, antes de se colocar em contato com CS2 e Au, foi investigado durante 120 min, não se registando

39 Após o tempo de modificação (16 h), os elétrodos foram cuidadosamente lavados com etanol e água milli-Q, a fim de remover as moléculas que não ficaram fortemente adsorvidas, e secos sob um fluxo constante de azoto.

Os elétrodos modificados foram caraterizados por técnicas eletroquímicas e por microscopia de força atómica.

Figura 2.4 – Esquema ilustrativo da metodologia usada para a funcionalização de superfícies de ouro envolvendo o CS2, nanopartículas, (Au, Pt, Fe3O4) e a

metaloporfirina (ou um derivado da vitamina B12).

Em suspensão coloidal, a funcionalização das nanopartículas decorreu conforme os procedimentos descritos em baixo e a respetiva caracterização foi realizada por espectroscopia de UV-visível:

i) 250 µL das AuNPs (20 nm) em suspensão coloidal foram misturados com 1.25 mL metaloporfirina (0.66 mM) previamente dissolvida em etanol. Após 2 min, a solução foi centrifugada, várias vezes, a 10000 rpm durante 20 min e o sobrenadante resultante de cada centrifugação foi removido e analisado por espectroscopia UV - vis. Os pellets foram imediatamente dispersos em água milli-Q até ao seu volume original e centrifugados novamente até que o espectro de UV-vis do sobrenadante não exibir qualquer banda de absorção de metaloporfirina;

ii) 250 µl das suspensões aquosas de Fe3O4NPs (20 e 40 nm) foram colocadas

em contato com 1.25 mL de metaloporfirina (0.66 mM), previamente dissolvidas em etanol, durante 2 min. Após este tempo, e utilizando um magnete, as soluções foram “lavadas” com água milli-Q, num total de cinco vezes, de modo a assegurar que apenas

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as espécies fortemente ligadas às nanopartículas estavam presentes, enquanto os compostos restantes foram removidos no processo de lavagem.

2.3.3 Formação de bicamadas lipídicas

Com o intuito de criar um ambiente biomimético mais apropriado para os eventos de bio-reconhecimento que ocorram nos imunossensores foram testados dois procedimentos diferentes de modificação de superfícies de ouro envolvendo a formação de bicamadas lipídicas suportadas em Au (figura 2.5). Um consiste na formação de uma SAM de ácido 11-mercaptoundecanóico na superfície do elétrodo antes da deposição do lípido e no outro, as vesículas preparadas já contém uma percentagem de um alcanotiol (1-decanotiol) sendo posteriormente depositadas no ouro.

Figura 2.5 – ilustração de dois procedimentos testados para a funcionalização de superfícies de ouro com base na deposição de bicamadas lipídicas.

i) Modificação de Au (111) com SAMs de ácido mercaptoundecanóico e decanotiol

A formação de monocamadas puras destes dois compostos foi efetuada por imersão de elétrodos de ouro numa solução com 1mM de cada composto em etanol durante 18 h. Após este tempo de incubação os elétrodos foram lavados

41 abundantemente com água milli-Q e etanol para remover as moléculas que não estão ligadas à superfície do elétrodo.

ii) Formação de bicamadas lipídicas suportadas de DPPC/colesterol (70:30 mol %) numa superfície de ouro previamente modificada com uma monocamada de MUA.

Preparação e deposição de vesículas unilamelares grandes (larger unillamelar

vesicles, LUVs):

Inicialmente, prepararam-se soluções de lípidos em clorofórmio espetroscópico. Retirou-se, para um tubo eppendorf, o volume desejado de cada solução para preparar os lipossomas constituídos por um ou mais lípidos. O solvente foi evaporado sob um fluxo suave de azoto, seguido de secagem sob vácuo 16 h. Os lípidos foram hidratados para uma concentração final de 1 mM com o tampão Hepes (10 mM, com 150 mM NaCl), encontrando-se o tampão a uma temperatura superior à temperatura de transição (Tm) dos lípidos (por exemplo, para o DPPC é de 41C). Em seguida a solução

foi submetida a agitação num vórtex e a 3 – 5 ciclos de congelamento (em azoto líquido) – descongelamento a T > Tm [12]. Para a deposição em ouro, a amostra foi

extrusada a 60C com um extrusor (Avanti Polar Lipids) contendo filtros cujo diâmetro do poro é de 400 nm, obtendo-se uma suspensão de LUV’s. Neste tipo de procedimentos, a utilização de um tampão contendo cálcio é importante, na medida em que este ião favorece a interação entre os lípidos e a superfície modificada [13, 14].

Da solução extrusada retiraram-se 150 μL que foram depositados sobre superfícies de ouro, com ou sem modificação, por um período de 1h numa estufa a ~ 60 C. Durante este período, as vesículas adsorvem à superfície do substrato, fundem-se e sofrem a rutura formando uma bicamada como esquematizado na figura 2.6.

Após este período, as amostras foram retiradas da estufa e colocadas à temperatura ambiente, seguindo-se um período de incubação de mais de 1 h. Para

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remover as vesículas que não se fundiram, a superfície de ouro foi lavada com tampão Hepes.

Figura 2.6 – Esquema ilustrativo da adsorção, fusão e rutura de vesículas na superfície de ouro.

iii) Preparação de bicamadas lipídicas suportadas em Au de DPPC/colesterol/decanotiol (65:30:5 mol %)

À solução stock de 1-decanotiol em etanol foi retirado o volume necessário para obter uma concentração final de 1mM, que foi adicionado ao DPPC e ao colesterol. Todos os compostos foram secos em conjunto. O procedimento subsequente para preparar as LUV com o tiol foi idêntico ao descrito anteriormente.

iv) Ativação da superfície de ouro modificada com a bicamada lipídica DPPC/Colesterol/decanotiol (65:30:5 mol %)

Após a formação da bicamada lipídica sobre a superfície de ouro e com o intuito de de imobilizar covalentemente o anticorpo para o evento de bioreconhecimento, o substrato foi submerso em 0.2 M EDC e 0.05 M de NHS durante 1 h, com o objetivo de ativar os grupos fosfatos dos DPPC’s [15]. Após este período, o substrato foi lavado com tampão Hepes.

As reações de reconhecimento biológico foram realizadas por ressonância de plasmão de superfície, elipsometria convencional, elipsometria de imagem,

43 elipsometria de imagem em modo de reflexão interna total e microscopia de força atómica.