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A interleucina-18 (IL-18), um membro da superfamília da citocina IL-1, foi originalmente descrita em 1995 por OKAMURA et al. como fator indutor de interferon-gama (IFN-gama). É atualmente reconhecida como uma importante reguladora das respostas imunes inatas e adquiridas.

A IL-18 é produzida constitutivamente em vários tipos celulares, incluindo macrófagos, células endoteliais, células dendriticas, células de Kupffer, queratinocitos, células intestinais e osteoblastos. Também é produzida em resposta a estímulos como o LPS (DINARELLO, 2002). Assim, como a IL-1b, com quem divide homologia estrutural, a IL-18 é gerada como um precursor, o pré-IL18, que permanece inativo até sua clivagem pela enzima caspase-1. A IL-18 exerce suas funções através da formação de um complexo de alta afinidade com o seu receptor, o IL-18R. A subsequente cascata de sinalização intracelular é semelhante a de outros membros da família IL-1. (NAKANISHI et al., 2001).

O papel efetor da IL-18 está rapidamente se expandindo. Esta citocina aumenta a maturação de células T e células natural killer (NK), bem como a produção de quimiocinas, moléculas de adesão e citocinas pró-inflamatórias como IFN-gama, TNF-alfa, IL-1 beta e IL-8. Suas atividades biológicas são reguladas negativamente pela proteína ligante de IL-18, garantindo a proteção do dano tecidual secundário à atividade inflamatória descontrolada (NOVICK et al., 1999).

A expressao de IL-18 tem sido descrita em doenças inflamatórias de um amplo espectro de tecidos. Artrite reumática, artrite psoriática, diabetes insulino- dependente, esclerose múltipla, asma, doença inflamatória intestinal e hepatite crônica são exemplos de condições onde esta citocina pode exercer um papel relevante. A IL-18 tambem tem sido relacionada à obesidade e síndrome metabólica (TROSEID et al., 2010), fatores fortemente relacionados a NASH. Sua relevância direta na patogênese da NASH secundária ou não ao irinotecano ainda é desconhecida.

1.5.3.4. Óxido nítrico

O oxido nítrico (NO) foi descoberto por Furchgott e Kawadzki (1980) como uma substância vasodilatadora derivada do endotélio. Em seguida foi reconhecido

estruturalmente como molécula de óxido nítrico por Ignarro et al. (1987) e Palmer et al. (1987). O NO tem um complexo e amplo espectro de ações e uma variedade de efeitos biológicos apenas recentemente descritos.

O NO é sintetizado pela óxido nítrico sintase (NOS), uma enzima da família das oxidoredutases. Três isoformas de NOS foram clonadas e caracterizadas. Todas elas geram NO através da conversão de L-arginina a L-citrulina por processo de oxidação. Duas das isoformas, expressas constitutivamente em neurônios (NOS1) e em células endoteliais (NOS3), respondem a agonistas que elevam a concentração de cálcio intracelular, como a trombina, a bradicinina, a adenosina difosfato e o stress vascular, e produzem NO em baixos níveis (concentrações picomolares). Em contraste a essas isoformas, a NOS2 (NOSi) tem sua expressão induzida por citocinas em macrófagos e outras células, e independente das alterações da concentração de cálcio intracelular. A NOSi tem atividade enzimática consideravelmente maior que as outras isoformas, levando a concentrações micromolares de NO (MURAD et al., 2006).

O NO produzido nas células endoteliais da microvasculatura é o principal determinante do tônus vascular em repouso. Também regula o fluxo regional, a ativação de células endoteliais e inibe a adesão, ativação e agregação plaquetária no endotélio vascular (RADOMSKI et al., 1987). Desta forma, o NO está envolvido no mecanismo de aterosclerose, hipertensão pulmonar e outras doenças cardiovasculares. O papel do NO também tem sido reconhecido em um número crescente de outros contextos clínicos. Assim, há evidências de que o NO oriundo da atividade da NOSi participa da fisiopatologia de doenças como enterocolite necrotizante, cistite hemorrágica (SOUZA-FILHO et al., 1997; RIBEIRO et al., 2002), pancreatite (GOMES-CAMBRONERO et al., 2000) e mucosite oral (LEITAO et al., 2007). O NO parece participar centralmente do mecanismo de algumas lesões hepáticas. Estudos demonstraram que os hepatócitos produzem NO após exposição a citocinas como TNF, IL-1, IL-18, em resposta a LPS e durante a inflamação hepática crônica (KIRKALI et al., 2000). Em modelos experimentais de NASH induzida por dieta, tem sido observado aumento da expressão hepática de NOSi (HA et al., 2010). Por fim, o NO parece estar envolvido nos processos de inflamação e fibrose hepáticas, que são alguns dos aspectos característicos da NASH (FUJITA et al., 2010).

Figura 6 _{– Regulação das vias de sinalização de citocinas da família da} interleucina-1 (IL-1). As citocinas da família IL-1 ativam alvos celulares através de receptores estruturalmente relacionados (família IL-1R/ Receptores Toll-like (TLR)) e vias de sinalização intracelular comuns, culminando com ativação de NF-_{B. Em} mamíferos não está claro se o LPS é um ligante direto de TLR-4 (ou CD14 em um complexo com MD2), ou se ele ativa uma cascata de proteases via PRR que por sua vez levaria à ativação de um ligante para TLR-4. Há grande similaridade de seqüência de ativação desde MyD88, IRAK4 e TRAF-6. Ligantes de citocinas e desses receptores atuam como reguladores endógenos sobre a ativação dessas

vias (por exemplo, IL-1Ra e IL-18bp). Outras vias de ativação em mamíferos envolvem a ativação de quinases de p38. Abreviações: MyD88: proteína de diferenciação mielóide 88; IRAK1/4: quinase 1/4 ativadora de IL-1R; TRAF6: fator 6 associado ao receptor de fator de necrose tumoral (TNF); TAK1: quinase 1 associada ao fator de crescimento transformador (TGF-_{); NEMO: modulador} essencial do fator nuclear _{B (NF-B); IkB: inibidor do NF-B; IKK1/2: quinase 1/2 do} IkB; MAPKK: quinase da proteína quinase ativada por mitógeno; JNK: quinase do n- terminal do c-jun (adaptado de HARBSKY et al., 2007).

1.6. JUSTIFICATIVA

O avanço na eficácia dos agentes antineoplásicos tem contribuído para o aumento da sobrevida de pacientes oncológicos. Entretanto, seus efeitos adversos podem representar uma limitação a este benefício.

O câncer coloretal (CCR) é uma das neoplasias mais prevalentes em todo o mundo e o fígado é o seu sítio mais freqüente de metástases. O tratamento curativo da metástase hepática envolve uma abordagem multidisciplinar que inclui quimioterapia e cirurgia. A quimioterapia utilizada antes do procedimento cirúrgico melhora as taxas de ressecção e de sobrevida.

O irinotecano é um dos agentes antineoplásicos mais ativos no tratamento do câncer coloretal. No entanto, o seu uso está associado a uma condição chamada esteatohepatite não alcoólica (NASH). A incidência dessa condição na clínica varia de 8 a10% nos pacientes expostos ao irinotecano. Pacientes com NASH induzida por irinotecano apresentam maior morbidade e mortalidade secundárias ao procedimento cirúrgico de ressecção hepática.

Não há, na literatura médica, nenhum modelo experimental de NASH induzida por irinotecano que mimetize as alterações encontradas na clínica. Igualmente não há nenhuma proposta de tratamento ou prevenção dessa condição em grande parte pela falta de conhecimento de sua patogênese.

Propomos desenvolver um modelo inédito de NASH induzida pelo irinotecano em camundongos que se aproxime ao máximo da síndrome descrita na prática clínica, bem como avaliar aspectos relevantes de sua patogênese.

2. OBJETIVOS 2.1. Objetivo geral

Estabelecer um modelo experimental de esteatohepatite induzida pelo quimioterápico irinotecano em camundongos.

2.2. Objetivos específicos

- Padronizar o modelo de esteatohepatite induzida por irinotecano em camundongos Swiss que apresente os parâmetros histopatológicos (através de escores microscópicos) e bioquímicos necessários para o diagnóstico na clínica;

- Avaliar a participação de alguns mediadores inflamatórios como citocinas (TNF, IL-1 e IL-18) e óxido nítrico assim como dos receptores Toll-like tipo 4, na patogênese da esteatohepatite experimental induzida por irinotecano.

- Avaliar a participação da translocação bacteriana intestinal e a bacteremia portal como indutora do insulto inflamatório hepático no modelo de esteatohepatite padronizado.

3. MATERIAIS E MÉTODOS 3.1. Material utilizado: