Behov for og virkning av havgående beredskap

Candida glabrata é uma espécie de elevada importância clínica que apresenta

elevada resistência aos antifúngicos mais usados em terapia clínica como o fluconazol [92]. Em alternativa a este agente, têm surgido novos triazóis com maior potência como o voriconazol, que tem sido usado no tratamento de infeções causadas por espécies resistentes ao fluconazol como C. glabrata [120,121]. A formação de biofilmes é um dos factores de virulência mais importante em espécies de Candida e a matriz presente nos mesmos, um dos principais mecanismos de resistência aos antifúngicos [155,188]. No entanto, há pouco conhecimento sobre a composição da matriz de C. glabrata e nenhum no que diz respeito ao papel que essa composição tem na resistência antifúngica dos biofilmes dessa estirpe. Assim, o objetivo do presente trabalho foi quantificar compostos presentes na matriz de biofilmes de C. glabrata expostos ao voriconazol, contribuindo para um melhor entendimento da sua elevada resistência. Para tal, foi inicialmente testada a suscetibilidade ao voriconazol de células plantónicas e biofilmes de três estirpes de C. glabrata (estirpe de referência ATCC 2001 e isolados clínicos de origem vaginal e urinária, 534784 e 562123 respetivamente). Posteriormente, analisou-se a matriz de biofilmes dessas estirpes expostos ao voriconazol em relação a proteínas, polissacarídeos e ergosterol e verificou-se a possível relação com a resistência inicialmente testada.

A suscetibilidade ao voriconazol, de células plantónicas das estirpes de C.

glabrata em estudo, foi analisada em termos de turbidez (visualmente) e de viabilidade

celular. Os resultados obtidos mostraram que todas as concentrações de voriconazol testadas (de 0,0375 a 8 µg/ml) provocaram diminuição do crescimento celular das três estirpes. Tal foi inferido pela diminuição da turbidez e da viabilidade celular (figura 10) nas células expostas ao antifúngico. Esses resultados mostraram também que a diminuição de crescimento celular das três estirpes foi dependente da dose de antifúngico. Assim, embora tenha havido uma diminuição significativa da viabilidade celular na presença das concentrações mais baixas de voriconazol, esta foi bastante menor que com as concentrações mais altas onde houve eliminação total da viabilidade. Esta dependência da dose está de acordo com um estudo sobre o efeito do voriconazol em C. glabrata [123], que observou igualmente inibição de crescimento plantónico desta espécie dependente da dose de antifúngico.

Nos testes de suscetibilidade de células plantónicas de C. glabrata determinou-

se a concentração mínima inibitória (CMI50) de voriconazol, tanto por análise visual

como da viabilidade celular. Os resultados obtidos nas duas análises (visuais e figura

10) indicaram valores de CMI50 concordantes para as três estirpes em estudo. A análise

visual permite determinar a concentração mínima de antifúngico que corresponde a aproximadamente 50% de inibição de crescimento em relação ao controlo positivo, de acordo com o definido pela Norma 27-A2 do NCCLS [199]. No entanto, a análise da viabilidade celular permite determinar mais concretamente por cálculo, com que concentração de antifúngico houve 50% de inibição, que neste caso foi entre 1 e 2 µg/ml de voriconazol. Tal permitiu também comprovar que a análise visual indicou um

valor de CMI50 (1 µg/ml) que de facto correspondia a aproximadamente 50% de

inibição. Tal como referido na Norma 27-A2 do NCCLS ainda não há dados suficientes sobre os novos triazóis como o voriconazol, para relacionar o valor da CMI com o resultado do tratamento com estes agentes. A Norma indica que os estudos com este

antifúngico têm mostrado valores de CMI50 que variam entre 0,03 e 16 µg/ml (nos quais

se baseou a escolha das concentrações de antifúngico a testar neste estudo) e que a

maioria das espécies apresenta CMI50 ≤ 1µg/ml [199]. De facto, um estudo de 2005 com

51 isolados clínicos de C. glabrata [124] mostrou valores de CMI50 de voriconazol entre

0,016 e 8 µg/ml e um outro estudo com 20 isolados clínicos dessa espécie [200] entre

0,008 e 4 µg/ml. Os valores de CMI50 de voriconazol obtidos neste trabalho para C.

glabrata são então concordantes com os estudos referidos, inserindo-se nos intervalos

mostrados pelos mesmos. Além disso, os resultados de CMI50 mostrados nesses estudos

para o fluconazol (valor médio de 32 µg/ml) são superiores aos obtidos neste trabalho para o voriconazol, mostrando maior actividade deste antifúngico em C. glabrata.

Os resultados dos testes de suscetibilidade de células plantónicas permitem então

concluir que as três estirpes de C. glabrata em estudo apresentam CMI50 de voriconazol

semelhante. No entanto, a inibição total do crescimento verificada para a estirpe de referência (C. glabrata ATCC 2001) com concentração de antifúngico mais baixa (2 µg/ml) do que nos isolados clínicos (4 µg/ml), sugere uma possível resistência superior por parte destes ao voriconazol.

A associação de microrganismos em biofilmes é uma forma de proteção para o seu desenvolvimento, incentivando as relações simbióticas e permitindo a sobrevivência em ambientes hostis [154]. Clinicamente, o fenótipo mais importante dos biofilmes é a sua extraordinária resistência à terapia antifúngica sendo até 1000 vezes mais resistentes

que os congéneres de células plantónicas [155]. Assim, nos testes de suscetibilidade de biofilmes de C. glabrata foram testadas concentrações de voriconazol substancialmente superiores (de 10 a 1000 µg/ml) às testadas em células plantónicas. O agente antifúngico foi adicionado a biofilmes pré-formados, em várias concentrações, e os biofilmes analisados em relação a viabilidade celular e biomassa. Os biofilmes de controlo positivo (figuras 11 e 12) mostraram que as três estirpes de C. glabrata em estudo formam biofilme em superfície de poliestireno nas condições dos ensaios. Isto está de acordo com um estudo [138] que reporta capacidade das espécies de Candida de formar biofilmes em diversas superfícies abióticas, incluindo poliestireno. Os biofilmes de controlo positivo das três estirpes apresentaram viabilidade celular semelhante (figura 11), o que não se verificou em termos de biomassa (figura 12). Os isolados clínicos apresentaram a maior e menor quantidade de biomassa de biofilme para as estirpes de C. glabrata 534784 e 562123 respetivamente, situando-se a estirpe de referência C. glabrata ATCC 2001 entre elas. Estes resultados estão de acordo com um estudo de 2010 [159] que mostrou igualmente semelhança na viabilidade celular de biofillmes destas três estirpes de C. glabrata e diferença na biomassa concordante com a obtida neste trabalho. Em comparação com os resultados da viabilidade celular, esta diferença na biomassa dos biofilmes reflete provavelmente diferença na quantidade de matriz produzida pelos biofilmes das três estirpes, já que a viabilidade celular é semelhante nesses biofilmes.

Os resultados da análise da viabilidade celular dos biofilmes das três estirpes de

C. glabrata em estudo (figura 11), mostraram que nem todas as concentrações de

antifúngico testadas tiveram efeito na viabilidade celular. As concentrações mais baixas de voriconazol (até 100 µg/ml) não tiveram qualquer efeito na viabilidade celular dos biofilmes em comparação com a dos biofilmes de controlo positivo. As concentrações de voriconazol mais altas (≥200 µg/ml) provocaram diminuição significativa da viabilidade celular dos biofilmes de todas as estirpes, tanto maior quanto maior a concentração testada. Os biofilmes de C. glabrata 562123 tiveram a maior diminuição, seguidos dos de C. glabrata ATCC 2001 e dos biofilmes de C. glabrata 534784 que tiveram a menor diminuição de viabilidade celular, sugerindo assim diferente resistência ao voriconazol.

Os resultados da biomassa de biofilmes das três estirpes na presença das várias concentrações de voriconazol (figura 12) mostraram que de forma geral estas provocaram diminuição da biomassa, tanto maior quanto maior a concentração testada.

Comparando esses resultados com os obtidos para a viabilidade celular verifica-se que as concentrações mais baixas de antifúngico levam à possível perda de matriz já que a viabilidade celular se manteve constante. Com as concentrações mais altas, tal como na viabilidade celular, houve diminuição significativa da biomassa dos biofilmes. A diferença na diminuição de biomassa nas três estirpes foi também concordante com a da diminuição de viabilidade celular, ou seja a maior e menor foram apresentadas pelos biofilmes de C. glabrata 562123 e 534784 respetivamente, sugerindo igualmente diferença na resistência dos biofilmes ao voriconazol.

Assim, de forma geral, os resultados dos testes de suscetibilidade dos biofilmes das três estirpes em estudo apontam para diferenças na resistência dos mesmos ao voriconazol. Sugerem então, maior produção de matriz e resistência ao voriconazol nos biofilmes da estirpe de origem vaginal (C. glabrata 534784) e menor nos da estirpe de origem urinária (C. glabrata 562113), situando-se os da estirpe de referência C.

glabrata ATCC 2001 entre essas. Não há estudos sobre a ação do voriconazol em

biofilmes destas estirpes que possam ser comparados com os resultados observados neste estudo.

As concentrações de voriconazol testadas nos biofilmes de C. glabrata não levaram em nenhum caso à ausência total de biofilme. Apesar de serem elevadas e bastante superiores ao nível de presença de voriconazol no sangue a partir do qual há aumento de toxicidade (5,5 mg/L [121]), não provocaram a destruição total dos biofilmes. Isto demonstra a elevada resistência destes biofilmes, comprovando a dificuldade do seu tratamento clínico. Sendo que, embora não total, se verificou diminuição de viabilidade celular e biomassa, é de interesse saber se houve destruição de parte dos biofilmes presentes no momento adição de antifúngico. Para tal, foram avaliados biofilmes pré-formados com apenas 24 h, sem antifúngico, que correspondem ao ponto em que foi adicionado o antifúngico. Os resultados (tabela 2) apresentaram-se concordantes com os obtidos por os biofilmes com 48 h de crescimento (sem antifúngico), ou seja, viabilidade celular semelhante nos biofilmes das três estirpes estudadas mas biomassa diferente e igualmente maior nos de C. glabrata 534784 e menor nos de C. glabrata 562123. Estes resultados apoiam assim o que já tinha sido sugerido como explicação para as diferenças de biomassa nos biofilmes das três estirpes, ou seja, que é representativa de diferentes quantidades de matriz produzida, já que a viabilidade celular é semelhante. Comparando os resultados da tabela 2 com os apresentados nos gráficos das figuras 11 e 12, verifica-se que houve de facto destruição

de parte dos biofilmes presentes aquando a adição de voriconazol, comprovando o carácter fungicida do antifúngico usado. Os resultados, tanto da viabilidade celular como da biomassa, mostraram que os biofilmes de C. glabrata 534784 são os que necessitam de maior concentração de voriconazol para que se verifique diminuição desses parâmetros em relação ao momento de adição de antifúngico. Os biofilmes de C.

glabrata 562123 são os que necessitam da menor concentração de antifúngico e os de

C. glabrata ATCC 2001 de concentração intermédia em relação à dos biofilmes dos

isolados clínicos. Estes resultados reforçam as diferenças de resistência já sugeridas entre os biofilmes das três estirpes.

Apesar de não se saber exatamente o mecanismo de resistência de biofilmes a antifúngicos é aceite que a matriz desempenha um papel essencial [188]. No entanto, há pouco conhecimento sobre a sua composição em biofilmes de C. glabrata, com apenas um estudo relativo a tal [150] e principalmente sobre a relação dessa composição com a resistência a antifúngicos, em que não há quaisquer estudos em C. glabrata. Assim, neste trabalho foi analisada a composição da matriz de biofilmes desta espécie com tratamento de voriconazol em relação a proteínas, polissacarídeos e ergosterol. As proteínas e os polissacarídeos são compostos já identificados como constituintes da matriz de biofilmes de C. glabrata por um estudo [150]. No entanto, o ergosterol é um constituinte nunca referenciado em estudos sobre a composição da matriz de espécies de

Candida.

A quantificação do conteúdo proteico na matriz dos biofilmes de controlo positivo (sem antifúngico, figura 13) indicou quantidade de proteína semelhante nos biofilmes das três estirpes. Os valores obtidos são um pouco inferiores aos mostrados, para as mesmas estirpes por o único estudo da composição da matriz de biofilmes de C.

glabrata [150]. Apesar disso, são igualmente superiores ao conteúdo proteico

apresentado nesse estudo para a matriz de biofilmes de outras espécies de CNA (C.

parapsilosis e C. tropicalis).

Na quantificação de proteína na matriz dos biofilmes tratados com voriconazol, os resultados (figura 13) mostraram que a presença do antifúngico levou à diminuição do conteúdo proteico da matriz, nos biofilmes das três estirpes de C. glabrata em estudo. Essa diminuição foi apenas ligeira com uma concentração de voriconazol baixa (10 µg/ml), mas significativa com uma concentração elevada de voriconazol (1000 µ/ml). A matriz que apresentou a maior redução de conteúdo proteico foi a dos biofilmes de C. glabrata 56213, seguida das matrizes dos biofilmes de C. glabrata

ATCC 2001 e 523784. Assim, comparando-se esses resultados com os anteriormente discutidos sobre a resistência ao voriconazol dos biofilmes das três estirpes, verifica-se que os biofilmes menos resistentes, ou seja, os de C. glabrata 562123, foram os que apresentaram maior diminuição de conteúdo proteico na matriz. E igualmente, os biofilmes mais resistentes ao voriconazol, ou seja, os do isolado clínico C. glabrata 534784, foram os que apresentaram menor diminuição de conteúdo proteico na matriz. Não há estudos publicados sobre a composição da matriz de C. glabrata na presença de quaisquer antifúngicos que possam ser comparados com os obtidos neste trabalho.

A quantificação do conteúdo em polissacarídeos das matrizes dos biofilmes de controlo positivo (sem antifúngico, figura 14) indicou diferença entre o conteúdo apresentado pelo biofilmes das três estirpes, embora não significativa. Comparando esses resultados com os mostrados no único estudo da composição da matriz de biofilmes de C. glabrata, anteriormente referido [150], são um pouco superiores mas concordantes com esses na diferença obtida entre as três estirpes. Assim, tal como se verificou neste trabalho, esse estudo mostra maior quantidade de polissacarídeos na matriz dos biofilmes de C. glabrata ATCC 2001, seguida das dos biofilmes de C.

glabrata 562123 e 534784. Além disso, os valores obtidos são igualmente superiores

aos apresentados por esse estudo para outra espécie de CNA (C. tropicalis).

Na quantificação de polissacarídeos na matriz dos biofilmes tratados com voriconazol, os resultados (figura 14) mostraram que a presença do antifúngico levou ao aumento do conteúdo em polissacarídeos na matriz, nos biofilmes das três estirpes de C.

glabrata em estudo. Este aumento foi ligeiro e não significativo com a concentração de

voriconazol mais baixa (10 µg/ml) mas significativo na presença da concentração mais alta de voriconazol (1000 µg/ml). Em C. albicans tem sido estudada a relação dos polissacarídeos da matriz com a resistência dos biofilmes, e em particular o β-1,3- glucano foi identificado como sequestrador de antifúngico, impedindo que este atinja o seu alvo celular [192, 194]. Embora não haja estudos em C. glabrata, os polissacarídeos têm possivelmente atuação semelhante na matriz dos biofilmes desta espécie e assim o aumento de conteúdo de polissacarídeos na presença de antifúngico poderá ser uma resposta por parte dos biofilmes que auxilie na sua resistência. A matriz que apresentou maior aumento do conteúdo em polissacarídeos foi a dos biofilmes de C. glabrata 562123, seguida das matrizes dos biofilmes de C. glabrata 534784 e ATCC 2001. Comparando-se estes resultados com os anteriormente analisados sobre o conteúdo proteico da matriz, verifica-se que a matriz dos biofilmes com a maior perda de proteína

teve o maior aumento de polissacarídeos (C. glabrata 562123). Assim, o aumento verificado de polissacarídeos poderá ser, além da já referida resposta para aumento da resistência, um indicativo de compensação de conteúdo matricial por parte dos biofilmes para a perda de proteína. Além disso, verificou-se também que mesmo na ausência de antifúngico a quantidade de polissacarídeos na matriz é bastante superior à quantidade de proteínas, nos biofilmes das três estirpes estudadas, o que está de acordo com o estudo da composição da matriz de C. glabrata já referido [150].

O ergosterol é um componente essencial da membrana plasmática dos fungos, que garante a sua integridade, fluidez, permeabilidade e funcionalidade proteica [98]. A biossíntese deste composto é bloqueada na presença de antifúngicos pertencentes à classe dos azóis como o voriconazol, pela inibição da enzima lanosterol 14-α- desmetilase codificada pelo gene ERG11 [98]. Estudos em biofilmes de C. albicans demonstram que a exposição aos azóis induz a sobrexpressão de genes que codificam enzimas envolvidas na biossíntese de ergosterol como o ERG1, ERG3, ERG11 e ERG25 [176,177], conferindo até dez vezes mais resistência comparativamente às mesmas alterações genéticas em células plantónicas [177]. Estes resultados poderão indicar uma possível transferência de ergosterol para a matriz, contribuindo para a limitação do antifúngico ao alvo celular, aumentando assim a resistência dos biofilmes. Embora não haja estudos em C. glabrata, estudos recentes noutras espécies de CNA como C.

parapsilosis [178] e C. dubliniensis [179] têm demonstrado comportamento de

sobrexpressão genética semelhante a C. albicans. Assim, supondo comportamento semelhante em C. glabrata, estudou-se a presença de ergosterol na matriz dos biofilmes das três estirpes em estudo, expostos ao voriconazol. Não há estudos publicados em biofilmes de nenhuma espécie de Candida que já tenham estudado a possível presença de ergosterol na matriz.

A quantificação de ergosterol na matriz dos biofilmes das três estirpes de C.

glabrata mostrou que de facto, este é um composto presente na matriz desta espécie

tanto na presença como na ausência de voriconazol (biofilmes de controlo positivo). Além disso, os resultados (tabela 3) mostraram que a presença de uma concentração elevada de voriconazol (1000 µg/ml) levou ao aumento de ergosterol na matriz dos biofilmes. Pelo que foi anteriormente referido, este aumento poderá ser um reflexo de sobrexpressão de genes envolvidos na biossíntese de ergosterol, havendo transferência deste composto para matriz dos biofilmes, possivelmente auxiliando a resistência dos mesmos. O maior aumento de ergosterol foi apresentado pela matriz dos biofilmes de C.

glabrata 534784, seguida da dos biofilmes de C. glabrata ATCC 2001 e o menor

aumento pela matriz dos biofilmes de C. glabrata 562123. Assim, comparando-se esses resultados com os anteriormente discutidos sobre a resistência de biofilmes das três estirpes ao voriconazol, verifica-se que os biofilmes mais resistentes ao voriconazol (C.

glabrata 534784) apresentaram o maior aumento de ergosterol na matriz. Da mesma

forma, os biofilmes menos resistentes ao voriconazol (C. glabrata 562123) apresentaram o menor aumento de ergosterol na matriz e os de C. glabrata ATCC 2001 tiveram um comportamento intermédio tanto na resistência ao voriconazol, como no aumento de ergosterol na matriz. Assim, de forma geral, o estudo dos compostos da matriz efetuado neste trabalho demonstra uma possível relação entre a composição da matriz de biofilmes de C. glabrata e a resistência dos mesmos ao voriconazol.

Há falta de conhecimento sobre a composição da matriz de biofilmes de C.

glabrata e sobre o papel que essa composição tem na resistência antifúngica dos

mesmos. Assim, este estudo é uma contribuição para o melhor conhecimento da composição da matriz de biofilmes desta espécie, com identificação de um composto nunca antes referenciado (ergosterol), mas também para um melhor entendimento da sua elevada resistência pela possível relação com a composição da matriz.