Este trabalho iniciou-se pela execução de testes de suscetibilidade ao voriconazol de células plantónicas de três estirpes de C. glabrata (ATCC 2001, 534784 e 562123). Foram testadas concentrações de voriconazol entre 0,0375 e 8 µg/ml e os resultados foram analisados visualmente e em relação à viabilidade celular, sendo determinada a concentração mínima inibitória (CMI) de antifúngico para cada estirpe.
Na análise visual, tal como recomendado pela Norma M27-A2 do NCCLS [199], comparou-se o crescimento celular das leveduras na presença de cada concentração de voriconazol testada com o respetivo controlo positivo (sem antifúngico), pela diferença da turbidez observada. As três estirpes de C. glabrata em estudo apresentaram decréscimo da turbidez relativamente ao controlo, tanto maior quanto maior a concentração de voriconazol testada. A referida Norma define a CMI para os antifúngicos da classe dos azóis (como o voriconazol), como a menor concentração que provoca decréscimo proeminente da turbidez em relação ao controlo, correspondente a aproximadamente 50% de inibição de crescimento. Tal como referido na Norma, esse decréscimo proeminente da turbidez é identificado pela classificação numérica dos resultados dos testes de suscetibilidade. A classificação varia entre 0 e 4, correspondendo o 0 a opticamente límpido, 1 a ligeiramente turvo, 2 a decréscimo proeminente da turbidez, 3 a ligeiro decréscimo da turbidez e 4 à não redução da turbidez [199]. Após a classificação dos resultados, verificou-se que tanto em C.
glabrata ATCC 2001 como nos isolados clínicos C. glabrata 534784 e 562123, a menor
concentração de voriconazol que levou ao decréscimo proeminente da turbidez em relação ao controlo (classificação de 2) foi de 1 µg/ml. Assim, pela análise visual, as três estirpes apresentaram para o voriconazol uma concentração mínima de inibição de
50% do crescimento (CMI50) semelhante e igual a 1µg/ml.
Os resultados dos testes de suscetibilidade das células plantónicas ao voriconazol foram também analisados em relação à viabilidade celular (pelo método de contagem de UFC), determinando-se a concentração celular viável em cada caso. A representação gráfica da figura 10 apresenta a concentração celular viável
logaritmizada, das três estirpes de
presença das várias concentrações de voriconazol testadas e controlo voriconazol).
Figura 10 – Representação gráfica da concentração celular
células plantónicas de três estirpes de concentrações de voriconazol ([voric]
significativa
Obervando a figura 10 verifica apresentaram menor concentração celular viável em cada estirpe) na presença
diminuição em relação ao controlo foi antifúngico testada, observando
glabrata ATCC 2001 a partir de 2
(testou-se até 8 µg/ml). Pela aplicação do teste de comparações múltiplas Dunnett verificou-se que a diminuição em relação ao controlo foi
(P<0,05) em todos os casos, com concentração de antifúngico mais baixa
comparações múltiplas Tukey, que permite comparar médias entre si, verificou também que as concentrações
apresentavam diferença estatistic
Tal como na análise visual, também os resultados da viabilidade celular foram usados para a determinação da
apresentados na figura 10 é possível a determinação numérica da percentagem de das três estirpes de C. glabrata (ATCC 2001, 534784 e 56123) presença das várias concentrações de voriconazol testadas e controlo
Representação gráfica da concentração celular viável logaritmizada (Log(células/m três estirpes de C. glabrata (ATCC 2001, 534784 e 562123)
voriconazol ([voric]) e respetivos desvios-padrão. (*Resultados com diferença significativa em relação ao controlo positivo (P<0,05))
a figura 10 verifica-se que as três estirpes de concentração celular viável que o controlo positivo
na presença de todas as concentrações de voriconazol testadas em relação ao controlo foi tanto maior quanto maior a concentração de
observando-se ausência total de concentração celular viável a partir de 2 µg/ml e nos dois isolados clínicos a partir de 4
. Pela aplicação do teste de comparações múltiplas Dunnett a diminuição em relação ao controlo foi estatisticamente significativa
s os casos, com exceção de C. glabrata 562123 na presença da concentração de antifúngico mais baixa (0,0375 µg/ml). Pela aplicação do teste de comparações múltiplas Tukey, que permite comparar médias entre si, verificou
s concentrações celulares viáveis dos controlos das três estirpes estatisticamente significativa entre si (P≥0,05).
Tal como na análise visual, também os resultados da viabilidade celular foram
ara a determinação da CMI50. Neste caso, recorrendo
apresentados na figura 10 é possível a determinação numérica da percentagem de , 534784 e 56123) na presença das várias concentrações de voriconazol testadas e controlo positivo (sem
logaritmizada (Log(células/ml)) de 562123) com diferentes
s com diferença
se que as três estirpes de C. glabrata positivo (primeira barra concentrações de voriconazol testadas. Essa tanto maior quanto maior a concentração de e concentração celular viável em C. isolados clínicos a partir de 4 µg/ml . Pela aplicação do teste de comparações múltiplas Dunnett, estatisticamente significativa 562123 na presença da Pela aplicação do teste de comparações múltiplas Tukey, que permite comparar médias entre si, verificou-se três estirpes não Tal como na análise visual, também os resultados da viabilidade celular foram aos resultados apresentados na figura 10 é possível a determinação numérica da percentagem de
redução em relação ao control
determinou-se que para as três estirpes de voriconazol de 1 e 2 µg/ml estirpes apresentaram para o vori
do crescimento (CMI50) de 1
Após a execução dos testes de suscetibilidade de células plantónicas foi também testada a suscetibilidade ao voriconazol
estudo. Testaram-se dez concentrações de vor positivo com biofilmes sem antifúngico) antifúngico mais 24 h na sua presença. termos de viabilidade celular (método com CV).
Na figura 11 encontra
de área, logaritmizada, dos biofilmes
534784 e 562123) na presença das concentrações de voriconazol testadas e controlo positivo.
Figura 11 – Representação gráfica da concentra
(Log (células/cm2)), de biofilmes de três estirpes de
diferentes concentrações de voriconazol ([voric]) e respetivos desvios diferença significativa
lação ao controlo positivo com cada concentração de antifúngico as três estirpes essa redução era de 50% entre as concen
µg/ml. Portanto, pela análise da viabilidade celular
para o voriconazol uma concentração mínima de inibição de 50% ) de 1-2 µg/ml.
Após a execução dos testes de suscetibilidade de células plantónicas foi também ao voriconazol de biofilmes das três estirpes de
concentrações de voriconazol entre 10 e 1000 µg/ml
biofilmes sem antifúngico) e os biofilmes cresceram durante 24 h sem na sua presença. Os biofilmes obtidos foram analisados em viabilidade celular (método de contagem de UFC) e biomassa
encontra-se apresentada a concentração celular viável dos biofilmes das três estirpes de C. glabrata na presença das concentrações de voriconazol testadas e
Representação gráfica da concentração celular viável por unidade de área
e biofilmes de três estirpes de C. glabrata (ATCC 2001, 534784 e 562123) com diferentes concentrações de voriconazol ([voric]) e respetivos desvios-padrão. (*Resultados com
significativa em relação ao controlo positivo (P<0,05))
com cada concentração de antifúngico. Assim, as concentrações e da viabilidade celular, as três uma concentração mínima de inibição de 50% Após a execução dos testes de suscetibilidade de células plantónicas foi também tirpes de C. glabrata em iconazol entre 10 e 1000 µg/ml (controlo am durante 24 h sem am analisados em biomassa total (coloração r viável por unidade
brata (ATCC 2001,
na presença das concentrações de voriconazol testadas e respetivo
por unidade de área, logaritmizada , 534784 e 562123) com
Observando a figura 11 verifica-se que as concentrações mais baixas de antifúngico não alteraram a concentração celular viável dos biofilmes das três estirpes, que se manteve semelhante à dos biofilmes de controlo positivo (primeira barra em cada estirpe), que são também estatisticamente semelhantes entre si (teste de Tukey, P≥0,05). Tanto nos biofilmes de C. glabrata ATCC 2001 como nos dos dois isolados clínicos, apenas concentrações iguais ou superiores a 200 µg/ml de voriconazol levaram à diminuição da concentração celular viável. A análise estatística (teste Dunnett), indicou que essa diminuição de concentração celular em relação ao controlo é estatisticamente significativa nos biofilmes das três estirpes (P<0,05).
Tal como se pode observar na figura 11, nos casos em que houve diminuição da concentração celular viável em relação ao controlo, esta foi tanto maior quanto maior a concentração de antifúngico testada. No entanto, a redução de concentração celular que essas concentrações provocaram nos biofilmes diferiu entre as estirpes, tendo a concentração mais baixa a provocar redução (200 µg/ml) maior impacto em C. glabrata 562123. De facto, comparando-se as percentagens máximas de redução em relação ao controlo, obtidas com a concentração de antifúngico mais alta (1000 µg/ml), os biofilmes de C. glabrata 562123 apresentaram a maior redução de 71,6%. Para os biofilmes de C. glabrata ATCC 2001 essa redução foi de 59,6% e a menor redução verificou-se nos de C. glabrata 534784 de 41,8%. Assim, nos biofilmes desta última estirpe não houve 50% de redução da concentração celular viável, que foi apresentada pelos biofilmes do outro isolado clínico (C. glabrata 562123) com 600 µg/ml de antifúngico e pelos da estirpe de referência (C. glabrata ATCC 2001) com 800 µg/ml.
Além da análise da viabilidade celular, a suscetibilidade dos biofilmes ao voriconazol foi também analisada em termos de biomassa. Após a coloração dos biofilmes com CV determinou-se a absorvância dos mesmos, que foi posteriormente
normalizada pela área de adesão (poços com 1,53cm2). A representação gráfica da
figura 12 apresenta assim a absorvância por unidade de área dos biofilmes das três estirpes de C. glabrata (ATCC 2001, 534784 e 562123), na presença das concentrações de voriconazol testadas e do controlo positivo.
Figura 12 – Representação gráfica da
estirpes de C. glabrata (ATCC ([voric]), após coloração com CV
significativas em relação ao controlo
Observando a figura 12 verifica biofilmes das três estirpes
estirpe), tanto maior quanto mai Estatisticamente (teste de Dunnett significativa (P<0,05) nos biofil concentrações de voriconazol 562123 com iguais ou superiores biofilmes em relação ao
µg/ml), foi de 56,5% em C. glabrata
glabrata 534784 e 562123,
viabilidade celular, os biofilmes apresentaram diferença estatistica
C. glabrata 534784 e a menor
Tal como já referido, os resultados de biomassa e viabilidade celular atrás apresentados correspondem à análise de biofilmes com 24 h de crescim
de voriconazol mais 24 h na presença do me
desses resultados com a viabilidade celular e biomassa momento de adição de antifúngico,
apenas 24 h de crescimento
áfica da absorvância por unidade de área (Abs/cm2) de biofilmes de três
(ATCC 2001, 534784 e 562123) com diferentes concentrações de voriconazol coloração com CV, e respetivos desvios-padrão. (*Resultados com diferenças
ificativas em relação ao controlo positivo (P<0,05))
a figura 12 verifica-se que houve diminuição da absorvância biofilmes das três estirpes em relação ao controlo positivo (primeira barra em cada
tanto maior quanto maior a concentração de voriconazol testada. teste de Dunnett), essa diminuição em relação ao controlo
nos biofilmes de C. glabrata ATCC 2001 concentrações de voriconazol iguais ou superiores a 200 µg/ml e nos d
com iguais ou superiores a 20 µg/ml. A redução máxima de
ao controlo, obtida com a maior concentração testada (1000
C. glabrata ATCC 2001 e de 46 e 62% nas estirpes
534784 e 562123, respetivamente. Contrariamente ao observado
os biofilmes sem antifúngico (controlo positivo) das três estirpes estatistica (P<0,05) na biomassa, com a maior nos biofilmes de 534784 e a menor nos de C. glabrata 562123.
Tal como já referido, os resultados de biomassa e viabilidade celular atrás apresentados correspondem à análise de biofilmes com 24 h de crescim
mais 24 h na presença do mesmo. Assim, para a possível
com a viabilidade celular e biomassa presentes nos biofilmes no momento de adição de antifúngico, foram avaliados esses parâmetros em
crescimento (sem antifúngico).
) de biofilmes de três , 534784 e 562123) com diferentes concentrações de voriconazol
(*Resultados com diferenças
a absorvância dos (primeira barra em cada de voriconazol testada. diminuição em relação ao controlo foi e 534784 com e nos de C. glabrata A redução máxima de biomassa dos obtida com a maior concentração testada (1000 2% nas estirpes de C. riamente ao observado na análise da das três estirpes a maior nos biofilmes de Tal como já referido, os resultados de biomassa e viabilidade celular atrás apresentados correspondem à análise de biofilmes com 24 h de crescimento na ausência a possível comparação presentes nos biofilmes no m biofilmes com
Os resultados da avaliação da viabilidade celular e da biomassa dos biofilmes com 24 h de crescimento encontram-se apresentados na tabela 2. Tal como nos gráficos da figura 11 a viabilidade celular é apresentada em termos de concentração celular viável por unidade de área, logaritmizada, e a biomassa, tal como nos gráficos da figura 12, em absorvância (após coloração dos biofilmes com CV) por unidade de área.
Tabela 2 – Resultados da viabilidade celular e da quantificação de biomassa (após coloração com CV) de
biofilmes de três estirpes de C. glabrata (ATCC 2001, 534784 e 562123) com 24 h de crescimento
Estirpe Viabilidade celular
(Log cél/cm2) Biomassa (Abs/cm2) ATCC 2001 8,723 ± 0,467 0,162 ± 0,026 534784 8,855 ± 0,443 0,258 ± 0,025 562123 8,617 ± 0,475 0,133 ± 0,028
Como se pode observar na tabela 2, os biofilmes com 24 h de crescimento das três estirpes, apresentaram viabilidade celular bastante semelhante (P≥0,05). O mesmo não se verificou nos resultados da análise da biomassa, em que os biofilmes de C.
glabrata 534784 apresentaram diferença estatisticamente significativa em relação aos
das outras duas estirpes (P=0,034 em relação a C. glabrata ATCC 2001 e P=0,007 em relação a C. glabrata 562123). A estirpe de referência C. glabrata ATCC 2001 e o isolado clínico C. glabrata 562123 formaram biofilmes com menos biomassa que os de
C. glabrata 534784 sem diferença estatisticamente significativa entre si.
Comparando-se os resultados da tabela 2 com os apresentados nos gráficos das figuras 11 e 12, verifica-se que tanto em termos de viabilidade celular como de biomassa, houve diminuição desses parâmetros nos biofilmes em relação ao momento de adição de antifúngico. Na estirpe C. glabrata ATCC 2001, concentrações de antifúngico iguais ou superiores a 400 µg/ml levaram à diminuição da concentração celular viável que os biofilmes apresentavam no momento de adição de antifúngico. Nos biofilmes dos isolados clínicos, tal verificou-se com concentrações de antifúngico iguais ou superiores a 800 e 200 µg/ml para C. glabrata 534784 e 562123, respetivamente. Em relação à biomassa, a diminuição de absorvância em relação à apresentada pelos biofilmes aquando a adição de antifúngico foi verificada na estirpe de
referência com concentrações iguais
glabrata 534784 e 562123
respetivamente.
2. Composição da matriz