Foi realizado um modelo da estrutura de MAPTc construído com base na estrutura cristalográfica da Metionina Aminopeptidase Humana tipo I, PDB 2B3H, com o auxílio do programa Discovery Studio 2.5 (Accelrys). A modelagem de uma proteína (proteína- problema) baseia-se no conceito da evolução molecular. Isto é parte-se do princípio de que a semelhança entre as estruturas primárias da proteína e de proteínas homólogas de estruturas tridimensionais conhecidas (proteínas-molde) implica em similaridade entre elas. A modelagem demonstrou, após minimização de energia, que a estrutura da MAPTc apresenta-se bem enovelada, com poucas alças diferentes daquelas encontradas na estrutura cristalográfica. Essa estrutura é característica da família pita-bread, Clan MG24, das metaloproteases, que apresenta domínios assimétricos entre as regiões amino e carboxi-terminal, formados por folhas β (Fig. 22).
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Figura 22. Modelagem molecular por homologia de sequência da metionina aminopeptidase humanos e de T. cruzi. O modelo (coluna da esquerda) e o molde (PDB 2B3H; coluna central)
foram sobrepostos (coluna da direita) em duas visões diferentes para melhor observação do posicionamento das estruturas secundárias.
Estudos de modelagem molecular dão suporte para entendimento da estrutura da proteína em questão e análises de dinâmica molecular de relaxamento serão necessárias para averiguarem-se possíveis interações intramoleculares desfavoráveis possam levar a uma perda de estrutura.
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Discussão
Apesar do alcance de grandes avanços tecnológicos e incentivos políticos para erradicação, a doença de chagas ainda destaca-se por ser um grande problema de saúde pública. Os números ainda indicam a importância social desta enfermidade, 100 anos após a descrição do primeiro caso agudo no Brasil (Silva et alii, 2010). Segundo dados da OMS, no Brasil há cerca de 6 milhões de habitantes infectados pelo T. cruzi, acentuando-se em populações pobres, que residem em condições profiláticas inadequadas associada a intensas migrações urbanas (Villela et alii, 2007).
O fato de ainda não existir uma quimioterapia eficaz para o tratamento da doença da Chagas com os antiparasitários tradicionais, nifurtimox e benzonidazol, tem impulsionado grupos de pesquisa a atuarem em busca de um tratamento eficaz da doença (Molina et alli, 2009). Nesse sentido, muitos estudos têm sido realizados com proteases que agem em fases vitais do ciclo de vida do parasito. Para vários autores, Knowles et alii., 1993; Gavigan et alii., 2001; Bastos et alii., 2005, as proteases em geral são consideradas alvos importantes para produção de drogas devido a sua importância de suas atividades enzimáticas no ciclo de vida de diversoso patógenos como T. brucei, Leishmania spp. e o T. cruzi , o que as tornam potenciais alvos terapêuticos. Estudo também tem sido realizado sob a biologia do sistema imunológico e a atuação do parasito na resposta imune, o que auxiliará na compreensão da imunopatologia da doença de Chagas e outras patologias. O conhecimento dos aspectos imunológicos leva ao desenvolvimento das diferentes formas clínicas e dos mecanismos responsáveis pela fase grave da doença (Neto, 1998).
Nesse contexto, nosso grupo tem se dedicado à caracterização molecular e funcional de enzimas que possam ter funções em processos vitais para o parasito, exibindo características de fatores de virulência e, portanto, de alvos potencias para ação de drogas. Esse estudo teve como enfoque uma metaloprotease, metionina aminopeptidase (MAPTc), cuja função é de grande relevância para os organismos uma vez que sua função é essencial para a fisiologia dos mesmos; caso ocorra deleção ou inibição desta enzima, o organismo alvo pode morrer.
O alinhamento de sequências protéicas de MAPs de cinetoplastídeos em relação à MAPTc permitiram concluir que há um alto grau de identidade entre essas sequências. Por outro lado o alinhamento realizado com as sequências de MAPs de humanos e E.coli revelaram uma similaridade de até 12% e uma identidade inferior a 3,5%, o que demonstra que MAPTc não apresenta uma homologia considerável entre as MAPs analisadas. Essa
45 característica é bastante desejada porque pode representar alvos específicos para o desenvolvimento de quimioterápicos bastante seletivos, o que resultaria em uma provável redução dos efeitos colaterais que são observados na terapia atualmente utilizada (Urbina, 2001) Os efeitos colaterais da medicação utilizada pelos pacientes, na maioria das vezes, estão associados com a redução da adesão ao tratamento e à falha terapêutica. Portanto, medicamentos específicos com efeitos indesejáveis minimizados são extremamente adequados (Fumaz et alii, 2009).
Os resultados da árvore filogenética permitem concluir que a separação do clados evidencia que MAPs são mais semelhantes entre as espécies diferentes do que entre si. Estudos filogenéticos demonstrados por (Bradshaw et alii, 1998) explicam que as MAPs divergiram evolutivamente o que explicaria, por exemplo a divisão de classes em classes de MAPs em eucariotos. E que essas classes de eucariotos estariam intimamente relacionadas com as de procariotos.
O gene foi amplificado no tamanho esperado, em quantidade suficiente e com relativa pureza. Posteriormente, foi realizada as etapas de clonagem no vetor pCR2.1(Invitrogen) e subclonagem no vetor pET19b (Novagen). Os vetores pET19b da Novagen e o pCR2.1 da Invitrogen e foram selecionados de acordo com trabalhos anteriores que demonstraram sucesso na clonagem de genes (Topcu, 2000; Ferchichi et alii, 2008). O resultado das análises de restrições visualizado em gel de Agarose demonstrou claramente a liberação de fragmentos no tamanho próximo ao esperado tanto para os inserto quanto para os vetores (Fig. 10 e Fig. 11B). E a partir dessa análise foram realizadas as etapas de excisão de bandas e purificação do DNA para ligação nos vetores de expressão. Nessa fase, a seleção do vetor de clonagem, pET19b, foi realizada de acordo com resultados de outros trabalhos e com a disponibilidade no laboratório (Passaglia et alii, 1998; Rea et alii, 2006). Com a confirmação no vetor de clonagem pet19b por análise de restrição e o sequenciamento do gene, iniciou-se os testes de expressão de MAPTc. Para isso, foram necessárias várias tentativas de induções, variando a quantidade de inóculo bacteriano, concentração do agente indutor, IPTG, temperatura e tempo de indução. Outra etapa crítica consiste na expressão da proteína recombinante, que pode ser bastante dificultada pelo sistema de expressão utilizado (Rosano et alii, 2009) ou ainda pelas condições utilizadas para a indução (Joshi et alii, 2005).Dentre vários testes foi possível obter uma MApTc expressa na fração solúvel a 37 ºC por 16 h com 1 mM de ITPG.
Após padronização do protocolo de expressão de MAPTc, observou-se uma dificuldade de purificação da proteína no tamanho esperado de 47 kDa, uma vez que uma
46 banda contaminante próximo a de MAPTc permanecia nos testes de purificação. Contudo, utilizou-se um inibidor de cisteíno protease, E-64, para que a purificação de MAPTc apresentasse apenas a banda no tamanho esperado. Foram testadas também outras condições de lise bacteriana, como lise por sonicação. Dessa forma, foi possível obter a MAPTc pura no tamanho esperado e na fração solúvel. Muito provavelmente, este inibidor foi capaz de restringir degradação da proteína de interesse e possivelmente de outras que eram co- purificadas.
Em seguida realizaram-se ensaios enzimáticos com MAPTc, utilizando o substrato fluorogênico MET-AMC. Primeiramente foram analisados protocolos a fim de obter uma melhor condição de atividade de MAPTc. Para isso, foram testados tampões como: Tris-HCl, NaCl, Hepes e DTT em concentrações de 25 e 50 mM, variou-se também, a temperatura e o pH ótimo da enzima de 6,5, 7,0 e 8,0. Testou-se também, tampões com e/ou sem íons metálicos já que os mesmos influenciam na atividade de muitas enzimas. Para (Lu et.alii 2009) esses íons são excelentes ativadores de atividade de metaloenzimas. Após várias tentativas, foi possível concluir que MAPTc não apresentava atividade enzimática nas condições conduzidas no experimento. Uma das hipóteses para essa ausência de atividade seria o fato de que a posição da cauda de histidina presente na região N-terminal no pET19b estaria impedindo dessa forma a exposição do sítio catalítico. Outra hipótese seria a o enovelamento incompleto ou errado da enzima pela E. coli.
Em paralelo foram realizadas imunizações em camundongos no intuito de conseguir anticorpos com MAPTc. Para isso, a proteína recombinante foi devidamente purificada com confirmação do tamanho esperado pelo perfil eletroforético necessários para imunização. Após as etapas de imunizações, foi retirado o soro dos camundongos e a produção dos anticorpos foi confirmada por immublotting utilizando extratos total, solúvel e insolúvel da forma epimastigota de T.cruzi. Realizou-se também experimentos de imunoflourescência com os soros imune utilizando parasitas na forma epimastigota de T.cruzi. As análises por microscopia permitiram concluir que MAPTc está presente em vesículas distribuidas por todo o citoplasma do T.cruzi. Isto significaria que o processamento de proteínas em nível de remoção de resíduo de metiona de suas porções N-terminais ocorre em todo o citoplasma do parasito, mas de forma bem organizada já que a enzima está localizada em vesículas.
Por fim, foram executados testes com o inibidor TNP470, utilizando parasitas nas suas formas epimastigotas. TNP 470 é um inibidor sintético derivado de fumagilina, atuando de forma covalente, modifica um dos sítios conservados de histidina presente em metionina aminopeptidase. MAPs de humanos foram identificadas como o primeiro alvo de fumagilina
47 e ovacilina, por ter apresentado um potente inibidor da angiogênese e demais tipos de câncer, demonstra uma baixa toxicidade e um efetividade inibitória (Addlagata et alii,2005). Muitos estudos de inibição têm sido realizados em mecanismos de angiogênese em humanos, impedindo a vascularização e a metástases de tumores. Pelo fato de ter sido reconhecido como um potente inibidor, TNP470 tem sido utilizado em estudos de inibição com parasitas como, por exemplo, em P. falciparum, Leihsmania donovani e outros parasitas (Chen et.alii, 2009).
Nestes testes de inibição foi avaliada a taxa de sobrevivência desses parasitos na presença de TNP470 em um determinado intervalo de tempo de até 72 h por contagem na câmara de neubauer. Após contagem dos parasitas observou-se que a 24 e 36 h houve um decréscimo na taxa de sobrevivência dos parasitas. Em contrapartida, nas demais tempos de contagem a taxa de sobrevivência dos parasitos na presença do inibidor e no controle permaneceram constantes. Várias tentativas foram feitas para o sucesso no teste de inibição, as hipóteses prováveis para esses resultados seria a ineficiência inibitória de TNP470 para T.cruzi ou as condições padronizadas no experimento. É possível que esse inibidor não possua atividade inibitória na enzima do parasito e/ou atravesse sua complexa membrana. A obtenção da MATPTc ativa poderá dar indicações sobre o entendimento na ineficácia deste inibidor sobre o T. cruzi.
Por fim, estudos foi proposto o estudo de modelagem da MAPTc que revelaram uma estrutura protéica característica das melaloproteases de “Pita bread”.Os estudos de modelagem molecular é uma ferramenta mais bem sucedida de predição de estruturas tridimensionais (Filho et alli, 2003). Em análises cristalográficas essas estruturas são bastante enoveladas, no qual é apresentada uma pseudo-simetria em domínios conservados. Esses domínios são formados por duas α hélices e duas fitas β antiparalelas com metais divalentes (Co+2 e Mn+2) situados no sítio catalítico (Lowther et.alii, 2000). A família “Pita bread” incluem outras subfamílias de aminopeptidases que são relacionadas à MAPs: prolidase (peptidase D,imidopeptidase ou aminopeptidase P de E.coli) (Giglione et alii, 2004).
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Conclusões
A partir dos experimentos realizados é possível concluir que:
• O alinhamento de sequências de cinetoplastídeo e MApTc demonstraram uma alta identidade.
• A análise por alinhamento também permitiu inferir que não há homologia s entre as MAPs de humanos e E. coli. Com uma similaridade significativa de 12% e uma identidade inferior a 3,5%.
• Por meio da análise filogenética com as 22 sequências de MAPs sugerem que a MAP II surgiu a partir de um evento ancestral. E que a conservação das duas famílias de MAPs em eucariotos, sugere a diversificação das funções das mesmas. • O gene codificante da proteína analisada foi clonado com sucesso, como previsto
pelas análises de informática realizadas anteriormente;
• De acordo com os parâmetros analisados a proteína recombinante MAPTc é expressa em sua forma solúvel e não ativa;
• Os anticorpos anti-MAPTc produzidos apresentaram especificidade; • A proteína MAPTc é expressa em T. cruzi em suas formas epimastigotas;
• A análise da modelagem molecular indica que MAPTc apresentou-se uma estrutura protéica característico das demais MAPs de diversos organismos.
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Perspectivas
Com o intuito de prosseguirmos com a pesquisa proposta nesse estudo, serão realizados novos testes de clonagem em vetores de expressão que possuem cauda de histidina em uma posição diferente do vetor utilizado na pesquisa realizada, o que possivelmente poderia estar influenciando na falta de atividade da proteína recombinante. Outra alternativa seria uma mudança no sistema de expressão, tendo em vista que muitos trabalhos descrevem a impossibilidade de alcançar sucesso na atividade da proteína recombinante com o sistema de expressão testado nesse trabalho e que utilizaram dessa estratégia. Em seguida, iniciaremos novas tentativas de ensaios enzimáticos para obtenção da proteína ativa. Serão realizados também novos experimentos de imunofluorescência com diferentes formas do T.cruzi para que se possa ter um resultado mais amplo da expressão de MAPTc. O inibidor TNP470 também será analisado nesses testes a fim de averiguar a ocorrência de possíveis mudanças fenotípicas em formas do parasito.
Por fim, após a obtenção da proteína recombinante ativa, iniciaremos estudos em relação à estrutura de MAPTc, como a dinâmica molecular, o que permitiria uma melhor caracterização funcional e molecular da proteína uma vez que essas análises são de grande relevância para o desenho racional de novos inibidores.
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