TREBALL FI DE GRAU
MICRORNAS: PRESENT I FUTUR EN LES CARDIOPATIES CONGÈNITES
Maria Victòria Llull Albertí
Grau de Bioquímica Facultat de Ciències
Any Acadèmic 2019-20
MICRORNAS: PRESENT I FUTUR EN LES CARDIOPATIES CONGÈNITES
Maria Victòria Llull Albertí
Treball de Fi de Grau Facultat de Ciències
Universitat de les Illes Balears
Any Acadèmic 2019-20
Paraules clau del treball:
MicroRNA; Cardiopaties congènites; Desenvolupament; Diagnòstic; Teràpia
Nom Tutor/Tutora del Treball Emilia Amengual Cladera
Nom Tutor/Tutora (si escau)
S'autoritza la Universitat a incloure aquest treball en el Repositori Institucional per a la seva consulta en accés obert i difusió en línia, amb finalitats exclusivament acadèmiques i d'investigació
Autor Tutor Sí No Sí No
☒ ☐ ☒ ☐
Resum
Les cardiopaties congènites (CC) són anomalies estructurals del cor que s’originen en el desenvolupament embrionari. Representen la causa més important de mortalitat i morbiditat infantil. Es considera que tenen una herència multifactorial, ja que només un 20% dels casos tenen una base genètica coneguda. La causalitat de la resta, a dia d’avui, encara es desconeix. A més, mostren un perfil característic d’herència autosòmica dominant amb penetrància incompleta. Per tant, hi ha una clara evidència de que les interaccions amb l’ambient són una part clau en el seu desenvolupament. Actualment s’accepta que es tracta de malalties complexes en les que la interacció genoma-epigenoma-ambient és clau per precipitar el fenotip cardíac. Estudis recents han revelat que les alteracions en l’expressió dels miRNAs, factor epigenètic capaç de regular l’expressió gènica, poden donar lloc a CC. Els estudis de screening i seqüenciació han permès identificar múltiples miRNAs i els seus gens diana. La seva presència en el plasma els converteix en potencials eines de diagnòstic perinatal no-invasiu. Així com el seu paper regulador i cardioprotector, en candidats terapèutics. L’objectiu d’aquesta revisió és comentar quina és la relació entre els miRNAs i les CC i quins possibles avantatges i avanços clínics suposa.Abstract
Congenital heart defects (CHD) are structural anomalies of the heart that originate during embryonic development. This disease represents the most important cause of children mortality and morbidity. CHD is considered to have a multifactorial inheritance, as only 20% of cases can be genetically explained. The rest of them have an unknown etiology. Moreover, they have a characteristic profile of autosomal dominant inheritance with incomplete penetrance.Therefore, there is a clear evidence that environment interactions are a key part of their CHD. It is now accepted that these are complex diseases in which the genome-epigenome-environment interaction is key for CHD development. Recent studies have revealed that alterations in miRNA, an epigenetic factor capable of regulating gene expression, can lead CHD. Multiple miRNAs and their target genes have been identified by screening and sequencing methods. Their presence in plasma makes them potential tools for non-invasive perinatal diagnosis. As well as its regulatory and cardioprotective role, in therapeutic candidates. The objective of this review is to comment the relationship between miRNAs and CHD, as well as the possible advantages and clinical advances that this entail.
2
ÍNDEX
1. Introducció: ... 3
1.1. Cardiopaties congènites:... 3
1.2. Capacitat diagnòstica actual de les Cardiopaties Congènites: ... 5
Diagnòstic prenatal ... 6
Diagnòstic post-natal ... 6
1.3. Teràpies actuals de les cardiopaties congènites:... 7
1.4. MicroARNs: ... 8
2. Objectius ... 12
3. Materials i mètodes ... 12
4. MicroRNAs com a eina de diagnòstic en les Cardiopaties congènites: ... 14
4.1. Defectes en el septe ventricular: ... 15
4.2. Defectes en el septe auricular: ... 16
4.3. Tetralogia de Fallot: ... 17
5. Perspectives de futur en l’ús dels microRNAs com a teràpia: ... 19
5.1. Aplicació dels miRNAs en l’enginyeria de teixits vasculars:... 22
5.2. microRNAs com a fàrmacs: ... 23
6. Conclusions ... 24
7. Bibliografia ... 25
3
1. Introducció:
1.1. Cardiopaties congènites:
Les cardiopaties congènites (CC) es defineixen com anomalies estructurals del cor que s’originen durant el període de gestació a causa de defectes en el desenvolupament embrionari. Els tipus d’anomalies associades a CC són molt variades i de distinta gravetat, havent-hi des de perforacions entre cambres, fins a malformacions més complexes que requereixen cirurgies delicades [1]. Les malformacions més comunes en les CC són defectes en els septes auriculars (DSA), defectes en els septes ventriculars (DSV) i la tetralogia de Fallot (TOF). Aquesta darrera alteració, la TOF, és resultat de la combinació de 4 alteracions estructurals alhora: estenosi pulmonar, comunicació interventricular, hipertròfia del ventricle dret i encavalcament de l’aorta (Il·lustració 1).
Il·lustració 1. Comparació entre un cor normal i els defectes més comuns de les CC. a) Cor sense cap defecte estructural b) Defecte en el septe ventricular c)Defecte en el septe auricular d) Tetralogia de Fallot (1.DSV, 2.encavalcament de l’aorta, 3.hipertròfia del ventricle dret, 4.estenosi pulmonar). (Adaptat de [2])
S’estima que les CC són la causa d’un 40% de les morts prenatals i més d’una quinta part de les morts en el primer mes de vida. A més, representen la causa més important de mortalitat i morbiditat infantil. La seva incidència a Europa és d’aproximadament 7/1000 naixements (sense tenir en compte els embrions que moren dins l’úter) [3]. Actualment, l’etiologia de les CC segueix sense ser clara, només un 20% dels casos tenen una base genètica coneguda, la qual cosa afavoreix l’acceptació d’un origen multifactorial del que ja es considera una malaltia complexa.
Aquesta gran incògnita ha donat lloc a estudis en profunditat de cardiopaties familiars i a la seqüenciació de nombrosos gens candidats per les CC. Els resultats rellevants d’aquests estudis han estat: 1) les mutacions relacionades amb CC en humans afecten a un conjunt heterogeni de gens que modulen el desenvolupament cardíac, 2) es tracta de mutacions que sovint alteren les
4
dosis de gens/proteïnes, 3) hi ha mutacions idèntiques que causen fenotips distints. Això posa de manifest l’existència de factors aliens a la pròpia genètica capaços de modular la penetrància de les mutacions existents.
La falta de coneixement i control sobre les modificacions epigenètiques específiques que afecten aquests malalts i la dificultat per identificar els factors ambientals rellevants entorpeix el seu estudi. En els últims anys s’ha demostrat que hi ha factors ambientals com certes malalties gestacionals o la pròpia dieta materna que podrien estar implicats en l’aparició de CC, degut a que poden modificar l’epigenètica de l’embrió i alterar l’expressió del seu genoma. Per exemple, l’àcid retinoic (AR), forma biològicament activa de la vitamina A, és un morfogen que participa en la regulació de gens teixit-específics durant el desenvolupament. La desregulació dels nivells d’AR causa alteracions en l’expressió d’aquests gens i en conseqüència, la morfologia del cor es veu afectada [4]. També, s’ha observat que distints ARNs no codificants poden condicionar l’aparició de CC gràcies a la seva capacitat d’interaccionar amb el genoma i regular-ne la seva expressió. En concret, s’ha vist que els microRNAs (en els quals es centra aquesta revisió) juguen un paper important en l’aparició de CC i serien part dels mecanismes epigenètics a través dels quals l’ambient podria alterar l’expressió gènica. Per exemple, en condicions normals, el miR-1 evita la hiperplàsia cel·lular del miocardi venticular perquè inhibeix la traducció del factor de transcripció HAND2 (factor que promou la hiperplàsia cel·lular). La disminució dels nivells de miR-1 han estat relacionats amb la hipertròfia cardíaca en models murins i malalties humanes associades a cardiopaties.[5]–[8]. Per aquest motiu, el model etiològic més afavorit per explicar aquesta malaltia és que les CC tenen una herència multifactorial en la qual la interacció genoma- ambient-epigenoma és decisiva [9].
Les CC es poden classificar en sindròmiques o aïllades, depenent de si la persona afectada presenta alteracions extra-cardíaques o no. Les CC sindròmiques poden aparèixer a causa d’aneuploïdies (Trisomia 21), duplicacions o delecions (Síndrome de la deleció en 22q11.2 o també anomenat Síndrome de DiGeorge) o a causa de defectes en un sol gen (Síndrome de Hold- Oram causat per la mutació en el gen que codifica pel factor Tbx5). No obstant, la majoria de CC són de tipus aïllat o no-sindròmic i tenen lloc esporàdicament. Com ja s’ha dit, mostren un perfil característic d’herència autosòmica dominant, en el que en la majoria dels casos s’observa una penetrància incompleta. Per tant, aquest fet afavoreix més la hipòtesi de que l’acumulació de gens i de factors epigenètics són la causa de l’aparició d’aquesta malaltia [10], [11].
La majoria de gens implicats en les CC aïllades codifiquen per factors de transcripció reguladors de la morfogènesi cardíaca. Alguns exemples són els factors de transcripció GATA (GATA4
5
implicat en DAS i DSV), factors de transcripció de la homeobox (NKX2.5 relacionat amb DAS i DSV) i factors de transcripció de la T-box (TBX1 implicat en TOF) [11] (Taula 1).
Taula 1. Relació dels defectes en les CC amb els gens afectats. En la taula apareixen alguns dels gens implicats en l’aparició de CC, la proteïna per la que codifiquen i el fenotip amb el que es relacionen quan estan mutats.Adaptat de [9], [11].
FT: factor de transcripció. DSA: defecte del septe atrial, DSV: defecte del septe ventricular, TOF: tetralogia de Fallot,
La modificació d’aquests gens provoca alteracions en els nivells de molècules senyals que participen en la cardiogènesi. A més, els distints tipus de mutacions tenen un impacte sobre la dosi genètica, l’activació/inactivació d’un factor de transcripció o l’activació/inactivació de tota una via de senyalització [9]. Com es pot observar en la Taula 1, els gens relacionats amb l’aparició de les CC són molts i a la vegada, l’alteració d’un mateix gen pot donar lloc a tipologies distintes.
Tot i que se’n podrien mencionar molts més, resulta ser un camp obert de molta d’informació que requereix ser organitzada. Per aquest motiu, s’ha considerat necessari limitar aquesta revisió a determinats gens, factors de transcripció i fenotips més comuns, amb l’objectiu de facilitar i millorar la comprensió i presentació de les dades.
1.2. Capacitat diagnòstica actual de les Cardiopaties Congènites:
Com s’ha comentat en l’apartat anterior, la majoria dels casos de CC tenen lloc de forma espontània a causa de mutacions de novo, modificacions epigenètiques i de l’efecte de
Gen Proteina Fenotip
GATA 4 HAND1,2 NKX2.5 TBX1 TBX20 JAG1 NODAL NOTCH
FT GATA4
FT Hèlix-loop-hèlix FT amb homeobox FT T-box 1
FT T-box20
Lligand de Jagged-1 Nodal de la família TFG-β Receptor NOTCH1
DSV, DSA, TOF TOF
TOF, DSA, DSV TOF
DSA, DSV TOF TOF DSV
6
l’ambient sobre el genoma. El principal problema d’això és que un elevat percentatge de nounats neixen sense ser diagnosticats i la prevenció deixa de ser una opció. El diagnòstic primerenc de les CC és important, ja que avançar-se permet preparar-se per realitzar una bona intervenció quirúrgica, elegir un tractament adequat o inclús plantejar l’opció d’interrompre l’embaràs a temps.
Diagnòstic prenatal
El principal mètode de detecció són els ecocardiogrames fetals. Es tracta de screenings mitjançant ultrasons que tenen una sensitivitat i especificitat d’entre el 85-99%. Tot i ser un aparell d’elevada resolució, una gran part dels afectats no són detectats durant l’embaràs, només 60% de les CC són detectades per ecocardiograma. El motiu d’aquest baix percentatge és que la qualitat de les imatges depèn de molts factors com l’adipositat materna o l’especialització i equipament dels centres que ofereixen el servei. Un problema afegit és que els centres especialitzats i amb millor maquinària solen ser privats i això suposa un elevat cost econòmic que no totes les famílies poden assumir [3], [12].
Per altra banda, com a diagnòstic prenatal de les CC, també s’utilitzen biomarcadors. Els biomarcadors es defineixen com qualsevol paràmetre o molècula que pot ser mesurada en el cos i que permet predir la incidència d’una malaltia específica. Actualment, els biomarcadors més utilitzats són: la gonadotropina-coriònica-humana-beta (β-hCG), baixos nivells de proteïna- A plasmàtica associada a l’embaràs (PAPP-A) durant el primer trimestre o nivells elevats de translucidesa nucal1. La utilització de biomarcadors garanteix major seguretat, tan per la mare com per l’embrió, perquè la seva extracció és una tècnica poc invasiva. No obstant, hi ha evidències de que els usats fins al moment no són específics i proporcionen un elevat nombre de falsos positius [3], [13].
Diagnòstic post-natal
Pel que fa al diagnòstic post-natal el seguiment és el següent: en primer lloc, es realitza una exploració física. Els signes i símptomes són distints segons el tipus de malformació i s’ha de tenir en compte que la simptomatologia pot ser semblant a la de patologies d’altres òrgans. Per
1 Translucidesa nucal: marcador econegatiu situat en la part posterior del coll del fetus.[34]
7
aquest darrer motiu, és important la valoració de l’historial clínic dels familiars. Els signes i símptomes més comuns d’una CC segons la Societat Europea de Cardiologia (ESC) són: un augment del rati respiratori i/o la cianosi. També és sospitós un xiuxiueig constant, tot i que en segons quins casos no s’ausculta fins que han passat uns dies des del naixement. En el cas de que es manifestin indicis de CC, el següent pas consisteix en realitzar un seguiment dels nivells de saturació d’oxigen (representats en un %) mitjançant l’oximetria de pols. El percentatge indica la quantitat d’oxigen que és transportat en sang en relació al màxim que l’infant podria transportar [14]. Si tots els resultats indiquen una possible CC, es realitza un ecocardiograma.
Tot i que en l’etapa post-natal és més fàcil realitzar un ecocardiograma que en etapes prenatals, sovint no proporciona tots els detalls necessaris per poder detectar on s’ha produït la malformació, per això la tomografia computeritzada pot servir d’ajuda. Quan la sospita de la CC apareix en etapes més avançades, adolescents o adults, també s’utilitzen tècniques com la radiografia al pit, la cateterització cardíaca o la ressonància magnètica [15], [16].
Els dos tipus de diagnòstics, prenatal i post-natal, avui dia segueixen sent poc precisos. A més, tampoc poden garantir resultats totalment fiables perquè els mètodes utilitzats com els ecocardiogrames depenen de mols de factors. Per aquest motiu, el percentatge de nounats no diagnosticats és tan elevat. Si el principal objectiu és afavorir la supervivència dels embrions amb CC i trobar una manera de prevenir la malaltia, és coherent pensar en la urgència de trobar mètodes de diagnòstic poc invasius que permetin la identificació de CC de la manera més ràpida i segura possibles [3], [12], [13].
1.3. Teràpies actuals de les cardiopaties congènites
Avui en dia fins a un 75% dels nounats amb una CC arriben a l’edat adulta amb el conseqüent increment de la incidència de malalties cardiovasculars associades com la insuficiència cardíaca (IC) [9]. Tot i així, els tractaments de les CC són molt limitats a causa de la heterogeneïtat de la malaltia. Això suposa un greu problema, ja que hi ha pacients que requeriran tractament pal·liatius de per vida. No obstant, això no passa en tots els casos. Si el defecte és lleu, la salut de l’individu no es veu afectada a llarg termini. Inclús algunes malformacions, com per exemple vasos amb un diàmetre petit, es corregeixen per si sols amb el pas del temps [17].
Malauradament, gairebé la meitat dels nounats amb CC són casos greus i requereixen intervenció quirúrgica immediata. A més, és freqüent que una intervenció no sigui suficient i que el pacient requereixi revisions i tractaments post-operatòries. També, al llarg dels anys, augmenten els factors de dany tissular a causa de l’envelliment, la qual cosa incrementa la
8
probabilitat d’acabar patint una insuficiència cardíaca. Tot això suposa que la despesa sanitària sigui major i per tant, és un motiu més pel qual és necessari trobar tractaments i mètodes de diagnòstic més efectius que els actuals.
Actualment, els possibles tractaments segons la Mayo Clínic (EUA) i la National Health Service (UK) són: operacions amb catèter amb l’ajuda de raigs X, operacions a cor obert (tot i que la preferència sempre són tècniques menys invasives), el transplantament de cor en casos molt extrems o també, la combinació dels anomenats. En el cas dels medicaments, s’utilitzen per estabilitzar i pal·liar els símptomes abans i/o després de la cirurgia. Els més utilitzats són inhibidors per a l’enzim que converteix l’angiotensina (ACE), bloquejadors del receptor de l’angiotensina II (ARBs) i β-bloquejadors que controlen la pressió sanguínia [15], [18].
Els resultats evidencien que en els darrers 40 anys, la gestió quirúrgica i mèdica de les CC ha evolucionat favorablement. Gràcies a això, el percentatge dels infants que arriben a l’edat adulta és tan elevat. No obstant, la mortalitat anual segueix sent elevada (~24.8%) i les cures pal·liatives no són suficients per garantir una bona qualitat de vida als infants amb una CC. Per aquests motius, és necessari invertir en tractaments que puguin millorar la qualitat de vida dels pacients [17].
1.4. MicroARNs i Cardiopaties congènites:
Els microRNAs (miRNAs) són un exemple de factor epigenètic que podria estar implicat en el desenvolupament de la gran varietat de manifestacions fenotípiques associades a CC, ja que tenen la capacitat de respondre a canvis a factors ambientals. Defectes en la seva expressió s’han relacionat amb l’aparició de malformacions característiques de les CC [19].
Els miRNAs són molècules d’ARN no codificants, d’entre 21-25 nucleòtids, que formen part del 60-70% del genoma que és transcrit però no traduït [20]. La majoria dels miRNAs humans es troben codificats en els introns de gens que codifiquen per proteïnes, així com també en trànscrits llargs no codificants (miRNAs intergènics). La seva funció consisteix en regular negativament i de manera post-transcripcional els mRNA diana. El seu mecanisme d’acció es basa en la complementarietat entre seqüències. Majoritàriament, els miRNAs s’uneixen a les seqüències 3’ no codificants (UTR) dels mRNAs. Un miRNA pot unir-se a més d’un mRNA. La interacció afecta a la producció proteica degut a que l’estabilitat del missatger i/o la seva traducció es veuen afectades [21].
9
Al 2005, la publicació de Bentwich I. et al ‘Identification of hundreds of conserved and nonconserved human microRNAs’ de la revista Nature revelava que en humans s’havien identificat un total de 800 miRNAs implicats en múltiples funcions cel·lulars com la proliferació, la diferenciació i l’apoptosi. La majoria d’ells, actuant com a moduladors dels mRNA que donen lloc a factors de transcripció [13]. La importància reguladora d’aquestes molècules va donar pas a estudis que es basaven en alterar la seva via de síntesi per tal de veure quines eren les conseqüències [7].
La via canònica de síntesi dels miRNAs (Il·lustració 2), el procés és iniciat en el nucli per la RNA pol II que transcriu al miRNA primari (pri-miRNA) en forma de forquilla. En segon lloc, un complex format per una RNAsa III Drosha i altres factors com DGCR-8, converteix el pri-miRNA en un pre-miRNA d’uns 65 nucleòtids. Tot seguit, el pre-miRNA és exportat al citoplasma a través d’una exportina (XPO5). En el citosol, Dicer, una endonucleasa, reconeix i talla el pre-miRNA a través del loop donant lloc dos miRNAs inestables d’uns 22 nucleòtids. A causa de la inestabilitat, el complex Dicer es manté unit a cada una d’elles. Preferentment, el miRNA amb l’extrem 3’
lliure (miRNA-3p) es degrada. Mentre que la seqüència amb l’extrem 5’ lliure (miRNA-5p) és incorporada al complex de silenciament induït per RNA (RISC). D’aquesta manera, el miRNA pot interaccionar per complementarietat d’uns 8 nucleòtids amb el seu mRNA diana i impedir la seva traducció o induir la seva degradació. De la manera descrita, la forma funcional del miRNA seria la miRNA-5p que amb l’ajuda del RISC s’uneix a la regió 3’UTR del missatger. No obstant, actualment hi ha certa controvèrsia perquè s’han trobat casos en els que el miRNA-3p també podria ser funcional,
degut a que pot unir-se a la regió 5’UTR del mRNA, donant lloc a la inhibició dependent de Cap [7].
Il·lustració 2. Biosíntesi dels miRNAs. Els enzims Drosha (nucli) i Dicer (citoplasma) són enzims clau per al processament dels pri- miRNA i pre-mRNA, respectivament. (Extreta de [7])
10
Estudis basats en la deleció d’enzims que participen en la biosíntesi dels miRNAs, han estat utilitzats per entendre i verificar la seva importància en les diferents etapes del desenvolupament embrionari. Els ratolins model knock-out pels enzims Dicer i Drosha moren en les primeres etapes del desenvolupament degut a defectes en el creixement. Aquests resultats evidencien el paper determinant dels miRNAs en el desenvolupament embrionari. No obstant, també hi ha altres fets que han demostrat la importància dels miRNAs en mamífers: els diferents perfils d’expressió dels miRNAs en les diferents etapes del desenvolupament, les semblances entre els patrons d’expressió de miRNAs entre els mamífers i altres espècies, i els estudis en cultius cel·lulars [12].
L’equip de Mineo et al. mitjançant seqüenciació massiva, va ser uns dels primers en identificar miRNAs que s’expressaven durant l’embaràs en ratolins. El seu treball consistia en rastrejar on es localitza cada miRNA en el genoma i el seu perfil d’expressió entre les etapes E.9.5 – E.11.5.
Els resultats varen revelar que la majoria dels miRNAs són intergènics i es situen en clústers policistrònics. Aquests clústers es transcriuen com un sol transcrit que després és processat i tallat, donant lloc a més d’un miRNA. També varen demostrar que la sa seva expressió durant el desenvolupament varia en funció del temps. És a dir, determinats miRNAs que es sobre- expressaven en una etapa en concret, llavors es deixaven d’expressar en una altra. Per exemple, els membres del clúster que ells anomenaren com a ‘cluster 7’, incrementaven des de la E.9.5 fins a la E10.5. Per contra, en la E.11.5 es re-establien els nivells d’expressió de la E.9.5, és a dir, disminuïen. Per tant, aquests resultats evidenciaven que l’expressió dels miRNAs segueix un perfil temps-específic. Estudis com aquest han facilitat l’obtenció del transcriptoma dels miRNAs, així com també la identificació dels seus mRNA diana [12].
A partir d’aquests estudis, s’ha comprovat que l’alteració dels nivells d’expressió dels miRNAs implicats en la cardiogènesi provoca anomalies morfogèniques del cor i dels vasos. Com a conseqüència de la desregulació dels miRNAs, les vies de diferenciació, proliferació i migració dels cardiomiòcits es veuen afectades. Nivells alterats de miRNAs han estat relacionats experimentalment amb malalties cardiovasculars, la qual cosa reforça la hipòtesi de què poden actuar com a factors epigenètics modulant l’expressió del genoma [6]. Centenars de miRNAs han estat identificats. En el cas d’aquesta revisió, ens centrarem en comentar alguns dels detectats en les CC més comunes: DSV, DSA i TOF. Alguns exemples apareixen en la Taula 2 i es farà una revisió més detallada en els següents apartats.
11
Taula 2. miRNAs presents en animals models amb defectes cardiogènics. En la taula es re laciona cada miRNA amb el seu gen diana i el fenotip resultant en funció del seu nivell d’expressió. Els marcats en vermell es corresponen a miRNAs implicats en l’aparició de CC. (Taula adaptada de [19])
Es podria pensar que coneixent cada un d’aquests miRNAs i les seves diana seria suficient per detectar l’origen de l’anomalia i posteriorment, trobar-ne una solució. No obstant, la regulació dels miRNAs té lloc en forma de ‘xarxes regulatòries’ a causa de que: a) un miRNA pot tenir més d’un mRNA diana, b) un mateix mRNA pot estar regulat per distints miRNAs, c) l’efecte depèn de si l’expressió del miRNA està agumentada o disminuïda, d) la regulació d’un factor de transcripció pot afectar a tota una via de senyalització, e) a la vegada, les vies de senyalització estan interconnectades entre elles i per tant, l’alteració d’una, pot suposar la desregulació d’una altra. En conclusió, es tracta d’un camp molt complex, en el que conèixer la funció i la diana d’un sol miRNA no és suficient per explicar la patologia [8], [12].
Un altre descobriment important relacionat amb els miRNAs ha estat la seva detecció, no només en el teixit afectat, sinó també en la placenta i el plasma matern. Aquest fet ha obert una porta a l’estudi dels miRNAs com a biomarcadors clínics de les CC atès que l’extracció de sang és un mètode poc invasiu tant per la mare com pel fetus. Paral·lelament, la millora de les tècniques de seqüenciació i microarrays han facilitat la detecció, identificació i quantificació d’aquests miRNAs. Per tant, amb una mostra de sang de la mare, es podria saber en l’etapa pre-natal la predisposició a una CC. [12], [22].
El reconeixement de la importància dels miRNAs i del seu paper en la remodelació tissular i la cardioprotecció obre les portes al seu possible ús com a teràpia cel·lular [23]. Aquesta teràpia no només pal·liaria les complicacions que suposa la cardiopatia a llarg termini, sinó que podria reparar completament el dany tissular. Així com també, evitaria els problemes de les cirurgies i
12
els rebutjos immunològics dels transplantaments [17]. Tot i així queda encara un llarg camí per recórrer. L’any 2019 es va publicar el treball en el que s’havia utilitzat el microRNA-199a per estimular la reparació de cors de porc infartats. Al cap d’un mes, van observar un increment de massa muscular i una disminució de la mida de la cicatriu. No obstant, l’expressió dels miRNAs no era controlat i al poc temps es van detectar arrItmies de les que van morir la majoria dels animals tractats [24]. Encara que hi ha molts d’aspectes a investigar per endavant, resultats com aquest són un avenç en l’ús dels miRNAs
com a teràpia. Un motiu de pes més per profunditzar en el coneixement de la seva funció.
2. Objectius
L’objectiu d’aquest treball és realitzar un estudi bibliogràfic sobre:
- El paper dels miRNAs en cada una de les malformacions més comuns amb les que es manifesten les cardiopaties congènites: defectes en el septe ventricular, defectes en el septe auricular, Tetralogia de Fallot.
- Aprofundir en el paper dels miRNAs com a biomarcadors per al diagnòstic perinatal de les cardiopaties congènites.
- La utilització dels miRNAs implicats en la formació del cor com a teràpia regenerativa després del part.
3. Materials i mètodes
Per la recerca d’articles relacionats amb les cardiopaties congènites i els microRNAs s’ha utilitzat la base de dades Pubmed. També s’han utilitzat articles extrets de la pròpia bibliografia trobada a la cerca inicial. La introducció de paraules clau com congenital heart disease, microRNA, diagnosis i therapy ha facilitat la selecció dels articles de més interès amb els quals es basa aquest treball bibliogràfic (Taula 3).
13
Taula 3.
Paraules clau utilitzades en la recerca
de la
bibliografia i el nombre de resultats per a cada una d’elles.
La selecció dels articles s’ha fet en funció del seu abstact, les conclusions i l’any de publicació.
Donant preferència als articles més actuals, tant en el cas de les cardiopaties congènites com el dels microRNAs. La majoria d’ells són treballs publicats entre els anys 2005 i 2019. És interessant destacar l’evolució dels resultats per la paraula microRNA en el gestor bibliogràfic de Mendeley, en el qual es pot observar un clar augment a partir de l’any 2005 (Il·lustració 3). Per la curiostat del que suposava això, es va consultar la revista Nature, amb l’objectiu de trobar alguns dels primers articles publicats sobre els miRNAs. Es va fer per recerca avançada utilitzant el terme
“microRNA” i consultant any per any (a partir del 2000) la quantitat d’articles que s’havien publicat. Sorprenentment, fins l’any 2003 els resultats de cerca eren 0 articles. En el 2003 només 7 articles varen ser publicats i en el 2004, 12. La major diferència es va observar des del 2004 al 2005, en el que es varen publicar un total de 20 articles amb el concepte microRNA. A partir d’aquest any, els resultats anaven augmentant de manera pronunciada.
Il·lustració 3. Captura de l’evolució de les publicacions sobre miRNAs en al base de dades Pubmed.
A més del cercador Pubmed, també s’ha utilitzat un Atles web de la Universitat de Minnesota (http://www.vhlab.umn.edu/atlas/congenital-defects-tutorial/normal-cardiac-
development/development-timeline-of-human-heart-embryology.shtml) com a suport per entendre a nivell anatòmic les malformacions característiques de les cardiopaties congènites i comparar-les amb l’estructura d’un cor sa.
Per consultar el mètode de diagnòstic i tractaments actuals, les consultes s’han fet en les pàgines web de tres institucions diferents: l’Associació Española de Pediatria (AEP), la National Health Services (NHS) de Regne Unit, l’hospital Mayo Clínic dels Estats Units.
Paraules clau Nombre de
resultats
(congenital heart disease) AND miRNAs 3259
((micrornas) AND biomarkers) AND congenital heart disease 1262 ((ventricular septal defects) AND microRNA) AND congenital heart disease 540 ((tetralogy of Fallot) AND miRNAs) AND congenital heart disease 239 ((congenital heart disease) AND microRNA) AND therapy 3015
14
4. MicroRNAs com a eina de diagnòstic en les Cardiopaties congènites
Els miRNAs són estables en el sèrum i no poden ser degradats per les RNAses. La seva presència i estabilitat en els fluids, els situa en una bona posició com a biomarcadors per el diagnòstic i pronòstic de les CC en l’etapa perinatal. A més, el perfil d’expressió característic per a cada tipus de CC, permetria diferenciar entre els distints fenotips possibles: DSV, DSA i TOF (i també d’altres menys comuns) [25]. La majoria dels estudis enfocats en l’anàlisi dels miRNAs com a biomarcadors, s’han basat en identificar els nivells d’aquests en individus amb CC mitjançant tècniques de screening i seqüenciació. La majoria de les troballes s’han realitzat mitjançant microarray i RT-PCR. Els anàlisis s’han fet a partir dels teixits afectats i sèrum (tant d’individus malalts com d’embarassades) [22], [25], [26], [12]. Com a exemple, el grup de Stephen et. al. al 2008 va identificar 4 possibles marcadors de CC associats amb l’embaràs. L’estudi va consistir en comparar els distints nivells d’expressió de miRNAs presents en la sang materna de dones embarassades control i dones embarassades d’embrions amb predisposició a patir una CC. Els resultats obtinguts es varen comparar amb els nivells de miRNAs en sang característics de pacients amb alguna de les tres CC: DSV, DSA, TOF (Taula 4). Aquest estudi va verificar la presència en sang de 4 miRNAs relacionats amb les CC, i a més, la permetre de distingir-los segons la tipologia [27].
Taula 4.Comparativa en els nivells d’expressió de miRNAs presents en la sang materna de dones embarassades. Els miRNAs que mostraren nivells d’expressió significativament diferents varen ser els marcats en vermell: mir-19b i mir-29c en els tres fenotips, mir-22 en la TOF, mir-375 per ASD i TOF(Taula extreta de [27])
Estudis com aquest suggereixen que els miRNAs podrien ser un bon mètode no-invasiu de diagnòstic per les CC. No obstant, un dels problemes que presenta és que el contingut de
15
miRNAs en sang no sempre coincideix amb el del teixit afectat. Per aquest motiu és necessari seguir amb l’estudi i la identificació dels miRNAs, per tal de convertir-lo en un mètode més precís [30].
Com ja s’ha comentat anteriorment, es tracta d’un tema molt ampli i variat que actualment segueix en estudi, la qual cosa dificulta la seva exposició. Per aquest motiu, a continuació, es dedicarà un apartat a comentar alguns miRNAs coneguts, els gens o factors de transcripció que regulen i es relacionarà cada un d’ells amb una de les tres CC (DSA, DSV i TOF) més comunes.
D’aquesta manera es volen aconseguir tres propòsits: 1) informar sobre miRNAs característics de cada CC, 2) demostrar que la majoria dels miRNAs són específics d’un fenotip concret, 3) suggerir que els miRNAs són una bona eina de diagnòstic.
4.1. Defectes en el septe ventricular:
Els defectes en el septe ventricular (DSV) es defineixen com a obertures en la paret que separa els dos ventricles. Aquest defecte provoca un flux anormal de la sang que va des del ventricle esquerre al dret. En conseqüència, augmenta el volum en el ventricle dret provocant una hipertensió pulmonar. Es tracta del defecte més comú en les CC, representant aproximadament un 20% dels casos [26].
Il·lustració 4. Fisiologia del defecte en el septe ventricular i miRNAs relacionats. Els 5 primers miRNAs es sobreexpressen, en canvi, els nivells d’expressió dels 10 últims, disminueix. Adaptat de [2])
En estudis com el de Dong Li. Et. Al. s’han identificat nivells baixos de miRNAs en el plasma de pacients amb DSV en comparació amb pacients sense DSV. Es destaca l’expressió diferencialment significativa (p<0.05) de tres miRNAs: hsa-let-7e-5p, hsa-miR-222-3p i hsa-miR- 433. Tots ells, actuen regulant l’expressió de gens implicats en la morfogènesi del ventricle dret com són NOTCH1, HAND1, ZFPM2 i GATA3 [26].
16
Més concretament, els gens diana de hsa-let-7e-5p són NOTCH1 i GATA3. NOTCH1 s’expressa en l’endocardi, mentre que GATA3 pareix estar relacionat amb la proliferació i diferenciació de les cèl·lules immunològiques T helper 2 i és important per el desenvolupament endotelial. Tant la baixa expressió del miRNA regulador hsa-let-7e-p5 com la dels gens NOTCH1 i GATA3, es lliga amb l’aparició de VSD. Per altra banda, la diana de hsa-miR-222-3p és el gen ZFPM2 que codifica pel factor de transcripció FOG2. Aquest factor de transcripció és l’encarregat d’inhibir la transcripció del gen GATA4, implicat en la compartimentalització del cor, el desenvolupament atrial i ventricular i la formació de la vàlvula atrioventricular [26].
4.2. Defectes en el septe auricular:
Es tracta de defectes en la paret que separa ambdues aurícues i que poden manifestar-se de distintes maneres segons la gravetat: des d’un sol forat a múltiples perforacions de petit diàmetre. Aquesta malformació permet el pas de la sang oxigenada des de l’aurícula esquerra a l’aurícula dreta. La majoria d’infants són asimptomàtics, depèn de la mida del forat i del grau de congestió cardíaca. En el cas dels adults els símptomes són més greus, poden desenvolupar dilatacions ventriculars i auriculars, insuficiència cardíaca o obstruccions pulmonars rares. Els pacients que no són tractats, poden arribar a patir cianosi que a la llarga provocarà una embòlia [1], [28].
Il·lustració 5. Fisiologia del defecte en el septe auricular. La sobre-expressió dels tres miRNAs causa DSA. (Adaptat de [2])
Pel que fa al perfil d’expressió dels miRNAs relacionats amb la DSA, la informació que es té és molt menor en comparació amb els identificats per DSV i TOF. En l’estudi de Song et al es varen identificar 3 miRNAs sobre-expressats: hsa-let-7a, hsa-let-7b i miR-486. Pareix ser que la seva expressió també està alterada en el DSV. Per altra banda, dos d’aquests, hsa-let-7a i hsa-let-7b també varen ser identificats en el plasma de mares embarassades d’infants amb DSA [2].
17
Un altre miRNA implicat en el desenvolupament de DSA és el descrit per Wang Ye et al que varen identificar una mutació patogènica en el gen ACTC1, el qual codifica per l’actina en el desenvolupament embrionari. Com a resultat d’aquesta mutació en la regió 3’UTR del gen ACTC1, apareix un nou lloc diana pel miRNA-139-5p, un miRNA implicat en la migració, proliferació i invasió cel·lular. Es va observar que la interacció entre aquest miRNA i el gen ACTC1 mutat, provocava una disminució de la seva expressió i en conseqüència tenien lloc els DSA [28].
4.3. Tetralogia de Fallot:
La tetralogia de Fallot (TOF) en pacients amb CC es caracteritza perquè apareixen quatre defectes estructurals del cor a la vegada: estenosi pulmonar deguda a un estrenyiment de la aorta pulmonar, DSV, l’encabalcament de l’aorta en el costat dret per damunt del DSV i la hipertròfia del ventricle dret. Es tracta de la CC cianòtica més comuna. Els pacients amb aquest tipus de CC poden patir distints graus de cianosi depenent de la gravetat de les quatre malformacions que el caracteritzen [29], [30].
Il·lustració 6. Fisiologia de la Tetralogia de Fallot. Cada número indica un defecte que caracteritza la Tetralogia de Fallot. 1) comunicació interventricular, 2) Estenosi pulmonar, 3) hipertròfia del ventricle dret. 4) encavalcament de l’aorta, (DSV), (Adaptat de [2])
Distints estudis coincideixen en que, en pacients amb TOF, els nivells alterats de miRNAs es localitzen en el ventricle dret. No obstant, aquests miRNAs desregulats no són els mateixos que s’han trobat en la seva sang d’individus que pateixen la malaltia. Això suposa major dificultat a l’hora del diagnòstic perinatal i post-natal perquè significa que la relació entre els resultats d’imatge obtinguts amb l’ecocardiografia i el contingut de miRNAs en sang no sempre es corresponen [30].
D’entre els miRNAs relacionats amb aquesta patologia es troben: miR-421, expressió del qual està inversament relacionat amb l’expressió del gen SOX4, regulador de la via de senyalització
18
Notch. També miR-424/424* i miR-22, sobre-expressió dels quals afecta a la proliferació i diferenciació dels cardiomiòcits. Per altra banda, la disminució en els nivells de miR-1 i miR206 provoca l’augment d’expressió de la connexina 43 (Cx43), de la qual es desconeix el mecanisme del que forma part [2].
Grunert M. et al i el seu equip, l’any 2019, van estudiar la relació entre els miRNA i els seus mRNA diana en el ventricle dret d’un grup homogeni de pacients amb TOF. Els resultats es van comparar amb els nivells de miRNAs presents en el ventricle dret i esquerre de cors sans. A més, també els varen posar en comú amb els resultats de quatre estudis diferents, en els quals s’havia fet el mateix procediment. Un total de 172 miRNAs tenien un perfil d’expressió significativament diferent en comparació amb els cors no afectats. Sorprenentment, tots ells compartien la desregulació d’un sol miRNA: miR-233-3p (Il·lustració 7). Però això no significa que fos l’única coincidència, sinó que era l’únic que apareixia en tots. L’expressió d’aquest miRNA en el ventricle dret es va veure disminuïda en tots els casos de TOF en comparació amb els ventricles dels cors sans. MiR-233-3p regula el transportador 4 de glucosa (Glut4) i el metabolisme glucídic dels cardiomiocits. La seva desregulació es caracteritza per una hipertròfia en el ventricle dret i un augment de pressió ventricular [30].
Il·lustració 7.
Comparativa per superposició dels nivells d’expressió de miRNAs en els ventricles drets de persones amb TOF versus individus amb cors sans. La il·lustració compara els resultats del
“present study” amb els resultats de les investigacions de O’Brien et Al., Zhang et al., Llang et al. i Wang et al. En total, 172 miRNAs estan desregulats en comparació als individus no afectats, però només un miRNA apareix en els resultats de tots els estudis, el miR- 233-3p. La seva expressió es veu disminuïda en els ventricles drets d’individus que pateixen TOF [30].
19
5. Perspectives de futur en l’ús dels microRNAs com a teràpia:
El nombre de pacients que arriben a l’edat adulta augmenta a mesura que avancen les noves tecnologies, les quals permeten realitzar cirurgies de cada vegada més complexes i en edats menys avançades. No obstant, els afectats requereixen tractament al llarg de la seva vida i, en la majoria dels casos, s’han de sotmetre a més d’una intervenció. A mesura que passen els anys, gràcies als avanços i als nous coneixements, es plantegen procediments diferents als convencionals que siguin menys invasius pel pacient. Trobar nous mètodes permetria fer front al problema de l’edat, ja que l’envelliment augmenta el dany tissular i les cirurgies passen a ser una darrera opció [20].
Un altre inconvenient relacionat amb l’edat, és que a l’hora de tractar nounats o infants la cirurgia es complica degut a la mida dels vasos i de les cavitats. Per exemple, en alguns casos s’implanten homoempelts2 (‘ homograft’ en anglès) per substituir vasos. El problema dels homeoempelts és que no es poden fer en nins petits degut a que no augmenten de mida a mesura que l’infant creix. Aquest també és un inconvenient en adults, ja que no són fàcils d’aconseguir i el diàmetre ha de coincidir amb les dimensions del que s’ha de reemplaçar [20], [29].
Principalment per aquests motius, les teràpies moleculars i la medicina regenerativa podrien ser una solució al problema. La capacitat dels miRNAs d’induir la diferenciació cel·lular que permeti regenar el teixit els converteix en potencials candidats [20]. No obstant, també suposen un risc elevat si són utilitzats sense control perquè podrien donar lloc a tumoracions, arrítmies, hipertròfies, malformacions i complicacions diverses. Per tant, invertir en l’estudi de la seva funció en el desenvolupament, així com les seves dianes, és primordial per poder-los utilitzar com a tractament. Fins al moment es sap que a mesura que les cèl·lules progenitores van madurant i es van acabant de diferenciar, els cardiomiòcits ja formats expressen miRNAs específics que s’encarreguen de retenir la mitosi. Per tant, no totes les cèl·lules finalitzen el procés de diferenciació D’aquesta manera, es manté la seva multipotencialitat (inclús s’ha arribat a pensar si algunes mantenen la pluripotencialitat). Són les que coneixem com a cèl·lules mare i cèl·lules progenitores, respectivament. És per aquest motiu que si un mamífer adult sofreix una lesió, questes cèl·lules s’activen ràpidament i es diferencien en cardiomiòcits, cèl·lules musculars llises i cèl·lules endotelials per tal de regenerar el miocardi (Il·lustració 7).
No obstant, aquestes cèl·lules representen un percentatge molt baix (~0,005-2%) de les cèl·lules
2 Homoempelt o homograft: es tracta d’un teixit obtingut de la mateixa espècie que el receptor i que és utilitzat com a empelt en les cirurgies dels vasos.
20
cardíaques adultes i a mesura que la lesió es perllonga, la capacitat de regeneració disminueix [19], [20].
Tot i així, està demostrat que hi ha una clara implicació dels miRNAs en l’adaptació cel·lular destinada a compensar els danys en cas de lesió per compensar els danys i com a exemple, es comentarà el paper dels miRNAs en la remodelació del ventricle dret [31].
Il·lustració 8. Alguns miRNAs
implicats en el
desenvolupament dels cardiomiocits. En la imatge apareixen distints miRNAs implicants tant en la
diferenciació dels
cardiomiocits (miR-503), com miRNAs que detenen el procés de proliferació com és el cas de miR-1 que inhibeix a Hand2. D’altres, com miR-1 i miR-133, eviten que la cèl·lula mare embrionària segueixi un
llinatge cel·lular
ectodèrmic/endodèrmic.
(Extret de[19]).
Per poder entendre com es duu a terme aquesta remodelació, s’han de tenir en compte dues coses: 1) el perfil d’expressió dels miRNAs varia en funció de la regió cardíaca, 2) aquestes diferències estan relacionades amb la fisiologia, és a dir, els dos ventricles tenen una morfologia diferent perquè la seva funció és distinta (el gruix de la paret del ventricle esquerre és major que la del ventricle dret perquè està exposat a condicions de pressió major). Per aquests dos motius, quan es manifesta alguna patologia, la resposta adaptativa de cada teixit és diferent. Això es veu reflexat segons els tipus de miRNA que s’altera. Per exemple, l’expressió de miR199a és significativament diferent en el ventricle dret en comparació amb l’esquerre quan la resposta al dany cel·lular implica hipertròfia (Il·lustració 9). Per tant, això demostra que els miRNAs estan implicats en la cardioprotecció davant estímuls agressius per la cèl·lula. El problema però, és que resposta hipertròfica dels cardiomiòcits no és permanent. En un moment determinat es reverteix i s’activa un programa d’estrès cel·lular: alteració en la síntesi proteica, canvis en els nivells de calci intracel·lular i apoptosi, entre altres. Aquests canvis també es corresponen amb canvis en el perfil d’expressió de determinats miRNAs. Per exemple, la finalització de la resposta adaptativa en el ventricle dret s’observa quan les concentracions del miR-34a augmenten respecte el ventricle esquerre. Aquest miR-34a s’associa a l’apoptosi cardíca. Per tant,
21
l’increment dels nivells del miR-34a en el ventricle dret està relacionat amb l’apoptosi cardíaca i l’envelliment. les alteracions en els miRNAs estan relacionades amb el canvi de programa:
d’adaptatiu/protector al patològic [31].
Il·lustració 9. Expressió diferencial dels miRNAs en funció del tipus de resposta cel·lular en el ventricle dret. A partir de ratolins model que patien arítmies i hipertensió pulmonar (PH) es va estudiar el perfil d’expressió espai-temporal de distints miRNAs en el ventricle dret. En la resposta adaptativa l’expressió de miR-1 (implicat en la proliferació cel·lular) disminueix, mentre que l’expressió de miR-199 (implicat en el creixement cel·lular) incrementa. Per tant, es promou la hipertròfia. (Extret de [31]).
Així doncs, entenent el paper regulador dels miRNAs, es podrien manipular in vitro els nivells d’aquests RNAs no codificants amb l’objectiu de modular el destí de les cèl·lules progenitores.
D’aquesta manera es podria aprofitar l’expressió correcta de miRNAs específics per obtenir el benefici clínic desitjat, com per exemple la remodelació dels ventricles o la vascularització del teixit. Fins al moment, estudis en models animals han demostrat que la seva manipulació és suficient per millorar o frenar processos patològics. A més, aquests models estan ajudant a estudiar el perfil d’expressió espai-temporal específic dels miRNAs en les cardiopaties i a entendre millor el seu paper en aquest tipus de malalties [31], [24].
22
Les teràpies basades en miRNAs provades en models animals consisteixen en inhibir el miRNA que suprimeix l’expressió del gen d’interès o bé, provocant l’augment dels nivells de miRNA que s’encarreguen d’inhibir el gen que causa el defecte [20]. Fins el moment, les teràpies basades en miRNAs s’han estat estudiant en models animals. Per poder veure’n l’efecte pràctic, en aquesta revisió es comentaran dos exemples d’aplicacions realitzades: l’ús dels miRNAs per l’enginyeria dels teixits i els miRNas com a fàrmacs.
5.1. Aplicació dels miRNAs en l’enginyeria de teixits vasculars:
L’enginyeria de teixits es basa en la producció de làmines tridimensionals cel·lulars que permetin obtenir estructures funcionals per poder substituir, mantenir o millorar la funcionalitat d’un teixit. Es basa en combinar els tipus de cèl·lules adequades perquè puguin proliferar i formar les làmines amb les senyals adequades i un esquelet sobre el que puguin expandir-se [20].
Il·lustració 10. Esquema visual del procés de l’enginyeria de teixits. El tractament correctiu es pot aplicar tan en infants com en adults. Els miRNAs permetrien reprogramar el cicle cel·lular amb l’objectiu de diferenciar les cèl·lules en cardiomiocits (CMCs), cèl·lules endotelials (ECs) i cèl·lules musculars llises (SMCs). (Adaptat de[32])
Les estructures vasculars s’obtenen a partir de cèl·lules de la sang diferenciades o bé, de cèl·lules progenitores a les que se’ls ha induït la diferenciació. Les millors candidates per poder formar les estructures vasculars són les cèl·lules musculars llises (CML). Es tracta d’unes cèl·lules amb molta plasticitat per diferenciar-se i proliferar segons les senyals que li arriben. L’activitat dels miRNAs específics de teixit s’utilitza per determinar el nivell de producció cel·lular i el tipus de cèl·lula que es vol aconseguir, en aquest cas, les CML [20].
23
És important que el procés es desenvolupi amb unes condicions favorables que es caracteritzen per la presència de factors de creixement cel·lular i d’una matriu extracel·lular. Aquesta matriu està composta per laminina, col·lagen, elastina i àcid hialurònic. Serveix com a suport per a l’adhesió, la proliferació, la migració i la diferenciació de les cèl·lules vasculars. D’aquesta manera es permeten les interaccions cèl·lula-cèl·lula i matriu-cèl·lula. Els miRNAs també són utilitzats per controlar la funció de la matriu. [20].
Pel que fa a les cèl·lules progenitores, uns miRNAs promouen la diferenciació de les CML com miR-143 i miR-145, i altres estimulen la proliferació com miR-221, -222. En canvi, en el cas de la producció de la matriu extracel·lular hi estan implicats miRNAs com miR-29a, del qual s’ha vist que antagonitzant les seves accions, es promou l’increment dels nivells d’elastina [20].
Les estratègies per introduir els miRNAs en les cèl·lules depenen de la teràpia i del teixit.
Normalment s’utilitzen plàsmids o oligonucleòtids, però plantegen el problema de la permeabilitat limitada de la membrana cel·lular i la seva activitat transitòria. Pel que fa a la introducció de les cèl·lules al teixit, les injeccions directes en el teixit han mostrat resultats òptims. Això es deu gràcies a que els andamis biodegradables sobre els que creixen les cèl·lules permeten actuar com a suport d’alliberació [20].
5.2. microRNAs com a fàrmacs:
Els miRNAs utilitzats com a fàrmacs es subministren dins liposomes o polímers biodegradables per evitar la possible degradació i la resposta innata immunològica que poden provocar. Els liposomes són bons transportadors perquè les seves càrregues catiòniques es compensen amb les càrregues negatives dels miRNAs. A més, s’ha comprovat que l’alliberació localitzada en el teixit a tractar proporciona millors resultats [33].
Recentment, empreses farmacèutiques estan realitzant assajos clínics amb fàrmacs que tenen com a diana determinats miRNAs. Consisteixen en oligonucleòtids sintètics anti-sentit contra miRNAs (AntimiR) diana als que regulen mitjançant la seva unió. Per exemple, el fàrmac Miravirsen és un AntimiR que inhibeix a miR-122 i va ser utilitzat en assajos clínics contra la infecció causada per el virus de la Hepatitis C. Aquest va ser el primer fàrmac amb un miRNA com a diana que va passar a la fase II [33].
Però també existeixen altres alternatives com és el cas de MRX34. Aquest fàrmac té com a finalitat alliberar un miRNA semblant al miR-34, un supressor tumoral. Es sap que en els pacients amb tumors, el miR-34 deixa de ser funcional o és reprimit. Per aquest motiu, al contrari que
24
passava amb el Miarvisen, no és que el miRNA sigui una diana del fàrmac, sinó que s’utilitza una còpia d’un miRNA com a fàrmac [33].
6. Conclusions
La identificació dels miRNAs com a factor epigenètic en el desenvolupament de les CC ha estat important per conèixer els seus efectes sobre una gran varietat de processos fisiològics i patològics dels quals se’n desconeixien les causes. Ha permès aprofundir en el coneixement del seu paper regulador en mecanismes moleculars que tenen lloc en el desenvolupament, com són la proliferació i la diferenciació cel·lular. També, ha permès donar una explicació a la diversitat fenotípica en la que pot manifestar-se una malaltia. Principalment, conèixer la funció dels miRNAs ens acosta de cada vegada més a entendre millor els mecanismes a través dels quals l’ambient interacciona amb el genoma. Així com també suggereix que l’especificitat espai- temporal i la seva capacitat regeneradora poden ser aprofitades com a eines clíniques de diagnòstic i de tractament. Tot i que els resultats obtinguts en els estudis que s’han dut a terme fins al moment hagin estat exitosos només parcialment, el potencial lligat al seu ús és molt encoratjador. Les evidències són clares: el miRNAs són elements claus en la majoria dels processos biològics i per això, entendre com funcionen ens permetrà avançar en l’àmbit clínic.
25
7. Bibliografia
[1] “Congenital Defects Tutorial - Normal Cardiac Development | Atlas of Human Cardiac Anatomy.” [Online]. Available: http://www.vhlab.umn.edu/atlas/congenital-defects- tutorial/normal-cardiac-development/development-timeline-of-human-heart-
embryology.shtml. [Accessed: 10-Mar-2020].
[2] O. Nagy, S. Baráth, and A. Ujfalusi, “The role of microRNAs in congenital heart disease.,”
EJIFCC, vol. 30, no. 2, pp. 165–178, Jun. 2019.
[3] Z. Yu et al., “Potential role of maternal serum microRNAs as a biomarker for fetal congenital heart defects,” Med. Hypotheses, vol. 76, no. 3, pp. 424–426, Mar. 2011.
[4] S. Stefanovic and S. Zaffran, “Mechanisms of retinoic acid signaling during cardiogenesis,” Mechanisms of Development, vol. 143. Elsevier Ireland Ltd, pp. 9–19, 01- Feb-2017.
[5] H. A. Çakmak and M. Demir, “Microrna and cardiovascular diseases,” Balkan Med. J., vol.
37, no. 2, pp. 60–71, 2020.
[6] T. Smith, C. Rajakaruna, M. Caputo, and C. Emanueli, “MicroRNAs in congenital heart disease,” Ann Transl Med, vol. 3, no. 21, p. 333, 2015.
[7] S. Pulignani and M. G. Andreassi, “MicroRNAs and Congenital Heart Disease: Where Are We Now?,” Rev. Española Cardiol. (English Ed., vol. 72, no. 1, pp. 7–9, Jan. 2019.
[8] T. Thum, D. Catalucci, and J. Bauersachs, “MicroRNAs: novel regulators in cardiac development and disease,” Cardiovasc. Res., vol. 79, no. 2, pp. 562–570, 2008.
[9] A. C. Fahed, B. D. Gelb, J. G. Seidman, and C. E. Seidman, “Genetics of congenital heart disease: The glass half empty,” Circulation Research, vol. 112, no. 4. Lippincott Williams and Wilkins, pp. 707–720, 15-Feb-2013.
[10] F. Pugnaloni, M. C. Digilio, C. Putotto, E. De Luca, B. Marino, and P. Versacci, “Genetics of atrioventricular canal defects,” Ital. J. Pediatr., vol. 46, no. 1, p. 61, Dec. 2020.
[11] T. Muntean, I., Togânel, R., & Benedek, “Genetics of Congenital Heart Disease: Past and Present ˘,” Springer New York LLC., 2017.
[12] J. Mineno et al., “The expression profile of microRNAs in mouse embryos,” Nucleic Acids Res., vol. 34, no. 6, pp. 1765–1771, 2006.
[13] I. Bentwich et al., “Identification of hundreds of conserved and nonconserved human microRNAs,” Nat. Genet., vol. 37, no. 7, pp. 766–770, 2005.
[14] G. Romera and J. Luis Zunzunegui, “35 Recien nacido con sospecha de cardiopatia congenita,” 2008.
[15] “Congenital heart defects in children - Diagnosis and treatment - Mayo Clinic.” [Online].
Available: https://www.mayoclinic.org/diseases-conditions/congenital-heart-defects- children/diagnosis-treatment/drc-20350080. [Accessed: 25-May-2020].
[16] “Treatment of heart failure in adult congenital heart disease: a position paper of the Working Group of Grown-Up Congenital Heart Disease and the Heart Failure Association of the European Society of Cardiology.” [Online]. Available:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4914888/?report=reader. [Accessed:
26 25-May-2020].
[17] N. Goloff and B. F. Joy, “A part of the team: The changing role of palliative care in congenital heart disease,” Progress in Pediatric Cardiology, vol. 48. Elsevier Ireland Ltd, pp. 59–62, 01-Mar-2018.
[18] “Congenital heart disease - Treatment - NHS.” [Online]. Available:
https://www.nhs.uk/conditions/congenital-heart-disease/treatment/. [Accessed: 26- May-2020].
[19] J. K. S. Pang, Q. H. Phua, and B. S. Soh, “Applications of miRNAs in cardiac development, disease progression and regeneration,” Stem Cell Research and Therapy, vol. 10, no. 1.
BioMed Central Ltd., 21-Nov-2019.
[20] M. Caputo, J. Saif, C. Rajakaruna, M. Brooks, G. D. Angelini, and C. Emanueli, “MicroRNAs in vascular tissue engineering and post-ischemic neovascularization,” Advanced Drug Delivery Reviews, vol. 88. Elsevier, pp. 78–91, 01-Jul-2015.
[21] G. C. Shukla, J. Singh, and S. Barik, “MicroRNAs: Processing, maturation, target recognition and regulatory functions,” Mol. Cell. Pharmacol., vol. 3, no. 3, pp. 83–92, 2011.
[22] S. S. C. Chim et al., “Detection and Characterization of Placental MicroRNAs in Maternal Plasma,” Clin. Chemestry, vol. 54, no. 3, pp. 482–490, 2008.
[23] T. Z. Nazari-Shafti et al., “MicroRNA Mediated Cardioprotection – Is There a Path to Clinical Translation?,” Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, vol. 8. Frontiers Media S.A., 20-Mar-2020.
[24] K. Gabisonia et al., “MicroRNA therapy stimulates uncontrolled cardiac repair after myocardial infarction in pigs,” Nature, vol. 569, no. 7756, pp. 418–422, May 2019.
[25] Y. Song et al., “Clinical significance of circulating microRNAs as markers in detecting and predicting congenital heart defects in children,” J. Transl. Med., vol. 16, no. 1, p. 42, Feb.
2018.
[26] D. Li et al., “Characterization of circulating microRNA expression in patients with a ventricular septal defect,” PLoS One, vol. 9, no. 8, Aug. 2014.
[27] S. Zhu et al., “Identification of maternal serum microRNAs as novel non-invasive biomarkers for prenatal detection of fetal congenital heart defects,” Clin. Chim. Acta, vol.
424, pp. 66–72, Sep. 2013.
[28] Y. Wang et al., “A gain-of-function ACTC1 3′UTR mutation that introduces a miR-139-5p target site may be associated with a dominant familial atrial septal defect,” Sci. Rep., vol.
6, May 2016.
[29] J. P. G. van der Ven, E. van den Bosch, A. J. C. C. Bogers, and W. A. Helbing, “Current outcomes and treatment of tetralogy of fallot [version 1; peer review: 2 approved],”
F1000Research, vol. 8. F1000 Research Ltd, 2019.
[30] M. Grunert, S. Appelt, I. Dunkel, F. Berger, and S. R. Sperling, “Altered microRNA and target gene expression related to Tetralogy of Fallot,” Sci. Rep., vol. 9, no. 1, Dec. 2019.
[31] S. Batkai, C. Bär, and T. Thum, “MicroRNAs in right ventricular remodelling,” Cardiovasc.
Res., vol. 113, pp. 1433–1440, 2017.
[32] S. Caddeo, M. Boffito, and S. Sartori, “Tissue engineering approaches in the design of
27
healthy and pathological in vitro tissue models,” Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, vol. 5, no. AUG. Frontiers Media S.A., 26-Jul-2017.
[33] C. Chakraborty, A. R. Sharma, G. Sharma, C. G. P. Doss, and S. S. Lee, “Therapeutic miRNA and siRNA: Moving from Bench to Clinic as Next Generation Medicine,” Molecular Therapy - Nucleic Acids, vol. 8. Elsevier Inc, pp. 132–143, 15-Sep-2017.
[34] D. Ramos, J. C. Santiago, M. J. Castillo, and F. Montoya, “Translucencia nucal,” Clinica e Investigacion en Ginecologia y Obstetricia, vol. 32, no. 2. Ediciones Doyma, S.L., pp. 54–
60, 01-Mar-2005.
